1、河南科技大学硕士学位论文牡丹叶斑病病原真菌鉴定及生物学特性研究姓名：段亚冰申请学位级别：硕士专业：植物病理学指导教师：康业斌20091201摘要论文题目：牡丹叶斑病病原真菌鉴定及生物学特性研究专 业：植物病理学研 究 生：段亚冰指导教师：康业斌教授摘 要随着我国牡丹种植面积的扩大、老园区种植年限的延长及对外交流频次的增加，发生在牡丹上的老病害为害日益严重，新病害种类不断增加，特别是真菌病害的为害已成为制约我国牡丹产业发展的重要因素之一。目前，我国关于牡丹病害的系统调查和病原鉴定工作研究的较少。本试验选择国家牡丹园、洛阳市国花园、白云山高山牡丹园等主要牡丹种植园、圃，对牡丹叶部真菌病害展开调查，
2、根据病害症状和病原菌的形态特征，并结合分子生物学手段进行病原分类鉴定。调查发现了牡丹叶部真菌病害 10 种，以黑斑病、叶霉病、红点病为害最为严重。其中牡丹黑斑病等 7 种病害的病原经形态学鉴定已经确定，分别是（ Alternaria. suruticosae 、 A. suruticosicola 、 A. tenuissima ） 、 芍 药 尾 孢（Cercospora paeoniae）、牡丹枝孢（ Cladosporium paeoniae Pass）、牡丹葡萄孢菌（Botrytis paeoniae Oudem）、牡丹白粉菌（Erysiphe paeoniae）、牡丹拟盘多毛孢（Pe
3、stalotiopsis paeoniae ）、斑点叶点霉（ Phyllosticta commonsii）。而牡丹红点病（菌株I）、瘤点病（菌株II）与叶斑病（菌株III）的病原仅靠形态学观察难以确定，需利用分子手段进一步研究。对分离纯化的菌株I、菌株II、菌株III 的 rDNA 的 ITS 序列进行了 PCR 扩增 ， 并 对 扩 增 产 物 进 行 了 克 隆 和 序 列 分 析 。 结 果 表 明 ， 菌 株 I、 菌 株 II 与GENBANK 中编号为AY487094.1的 Pilidium concavum ITS 区段进行了比对，其同源性分别为 100%和 99.58%，表明
4、菌株I 和菌株II 均为 Pilidium concavum；菌株III 初定为双毛壳孢属真菌 Discosia sp.。对 Pilidium concavum 生物学特性的研究结果表明，该菌菌丝生长的最适培养基为 PDA，分生孢子产生的最适培养基为 PYA。在最适培养基上培养，菌丝生长的最适温度为 25，产孢的最适温度为 30；在 pH 值 611 范围内该菌均能生长和产孢，菌丝生长的最适 pH 值为 6，pH 值为 11 时产孢最好，pH 值为5 时孢子萌发达到最大；光照对菌丝生长、产孢及孢子萌发无显著影响；在供试的碳源中，菌丝生长及产孢均以葡萄糖最好，氮源以酵母膏最好；RH 在 65%1
5、00%孢子均能萌发，萌发率随湿度增大而升高，在饱和湿度时萌发率最高，达I摘要到 94.51%；孢子的致死温度为 51 10min。本试验以形态学为基础，在分子水平上鉴定了牡丹叶斑病病原真菌，发现了Pilidium concavum、Discosia sp.两种国内新病原，探讨了 P. concavum 的生物学特性，对进一步揭示牡丹真菌病害及其防治具有重要意义。关 键 词：牡丹，叶斑病，病原真菌，形态鉴定，分子鉴定，生物学特性论文类型：应用基础研究II摘要Subject: Study on the Identification and BiologicalCharacteristics of
6、Pathogenic fungi of Peony leaf spotSpecialty: PhytopathologyName: Yabing DuanSupervisor: Professor Yebin KangABSTRACTWith the expansion of cultivated area and plant life of Peony in China and theincrease in frequency of foreign exchange, new diseases continue to rise and thedamage of old diseases, e
7、specially fungal diseases, has been a key facter in restrictingthe industrial development of Peony in China. Currently, the studies on systematicinvestigation of peony diseases and pathogen identification0 is very little in ourcountry. In order to investigate the peony leaf fungal diseases, this stu
8、dy selected thecountry Peony Garden, Luoyang City of Garden, Baiyun Mountain Alpine PeonyGarden and other major peony plantations, nurseries to identify pathogens according tosymptoms and morphology, combined with molecular biology characteristics.Ten kinds of fungal diseases were found and black sp
9、ot, leaf mold and red spotare the most serious diseases. Seven kinds of pathogens included black spot had beenidentified on morphology, and they were Alternaria suruticosae, A. suruticosicola,A. tenuissima, Cercospora paeoniae, Cladosporium paeoniae Pass, Botrytis paeoniaeOudem, Erysiphe paeoniae, P
10、estalotiopsis paeoniae and Phyllosticta commons.However, Peony red spot (strain 1), Peony tumor spot (strain 2) and Peony leaf spot(strain 3) were difficult to determine by their morphological character alone, so furtherstudy is needed at the molecular level.PCR amplification products of ITS of rDNA
11、 of the three strains obtained weresequenced. Compared strain1 and strain 2 with the ITS sequnces of Pilidiumconcavum numbered AY487094.1 of GENBANK, the homologies were 100% and99.58% seperately. The results showed that both strain 1 and strain 2 were Pilidiumconcavum, while strain 3 is Discosia sp
12、.Studies on the biological characteristics of Pilidium concavum showed that theoptimum grown was PDA, the optimum sporulation was PYA. The optimum growntemperature was 25, the optimum temperature for sporulation was 30. TheIII摘要optimum growth pH was 6, sporulation was a maximum of pH 11. Light had n
13、osignificant effect on mycelial growth and sporulation. Glucose and yeast were the mostsuitable carbon and nitrogen sources for mycelial growth. Conidia germinated duringRH 65%-100% and the germination rate increased with the increase of RH. when RHis saturated, spore reached its maximum germination
14、 rate 94.51%. The lethiferoustemperature of conidia was 51 for l0 min.In this study, based on morphology, pathogenic fungi of Peony leaf spot werefurther identified at the molecular level. The results indicate that Pilidium concavumand Discosia sp. are new pathogens on Peony in our country. Biologic
15、al characteristicsof P. concavum had a great significance on further revealing the prevention andtreatment of fungal diseases of peony.KEY WORDS: Peony, leaf spot diseases, pathogenic fungi, morphologicalidentification, molecular identification, biological characteristicsDissertation Type: Applied b
16、asic researchIV缩略语词汇表缩略语词汇表Abbreviations缩写词PDADNAITSGenBankTrisEDTATETAEEBCTABPCRdNTPBLASTODDDBJEMBLPDBNCBIbpPSACzapekOMACMAPYAPCAYAWARHCK66英文全名Potato dextrose agarDeoxynculeoside acidInternal transcribed spacerGenBankTris(Hydroxymethyl)aminomethaneEthylene Diamine Tetraacetic AcidTris & EDTATris &
17、Acetate & EDTAEthidium bromideHexadecyl trimethyl ammonium BromidePolymerase Chain ReactionDeoxy-ribonucleoside triphosphateBasic Local Alignment Search ToolOptical DensityDNA Data Bank of JapanEuropean Molecular Biology LaboratoryProtein date bankNational Center of Biotechnology InformationBase pai
18、rPotato sucrose agarCzapeks mediumOatmeal agarCorn agarPotato yeast agarPotato carrot agarYeast agarWater agarRelative humidityCheck中文全名马铃薯葡萄糖琼脂培养基脱氧核糖核苷酸内转录间隔区美国 DNA 序列数据库三羟甲基氨基甲烷乙二胺四乙酸TE 缓冲液TAE 电泳缓冲液溴化乙锭十六烷基三甲基溴化铵聚合酶链式反应三磷酸脱氧核糖核苷局部相似性查询工具光密度日本 DNA 数据库欧洲 DNA 数据库蛋白质数据库美国国立生物技术信息中心碱基对马铃薯蔗糖琼脂培养基查氏培养基燕
19、麦片琼脂培养基玉米粉琼脂培养基马铃薯酵母膏琼脂培养基马铃薯胡萝卜琼脂培养基酵母膏琼脂培养基琼脂培养基相对湿度对照第 1 章 文献综述第1章 文献综述牡丹（Paeonia suffruticosa Andrews）隶属于芍药科（Paeoniaceae ）、芍药属（Paeonia L.）、牡丹组（Sect. Moutan DC.）1。别名洛阳王、百花王、鹿韭、木芍药、富贵花等，是多年生落叶小灌木，革质或肉质，花朵硕大、风姿华贵、色彩艳丽、仪态万方、品种繁多，深受中国人民喜爱，有“国色天香” 、“花中之王”、“天都神花”之美称，居中国十大传统名花之首，也是世界上著名花卉之一，具有很高的观赏和药用价值
20、2-5。洛阳牡丹栽培历史悠久，品种齐全，花大色艳6，经过多年来的大力发展，洛阳现已有牡丹品种 700 多个，3000余万株，种植面积近万亩，已建成的规模化的牡丹园 30 多个7,8，且观赏牡丹与商品牡丹并存，不仅遍布全国，还闻名世界，每年都有数万株的牡丹苗木、催花牡丹及鲜切花走出国门，远销美国、日本、澳大利亚、新西兰、阿根廷、欧盟等20 多个国家和地区。1.1 我国牡丹的地理分布及特点1.1.1 野生牡丹地理分布及特点我国是牡丹分布、起源、演化的中心，目前已经查明的野生种有 9 种、1 亚种、2 变种、1 变型。纵观历史资料记载2，结合李睿等9 对我国野生牡丹分布的调查，将我国野生牡丹划分为两
21、大分布区域。1.1.1.1 黄土高原秦巴山地川西北高原分布区该区以秦岭为界，南北分别属于北亚热带和暖温带气候。北亚热带气候区植被为常绿阔叶、落叶常绿阔叶、落叶阔叶林地带；暖温带气候区植被为森林草原或落叶阔叶林地带。该区是牡丹组（Sect. Moutan DC.）革质花盘亚组（subsect.Vaginatae）的分布区，主要有矮牡丹（稷山牡丹 Paeonia jishanensis）、紫斑牡丹（Paeonia rockii）、杨山牡丹（ Paeonia ostii）、卵叶牡丹（Paeonia qiui）、四川牡丹（Paeonia decomposita）。其主要野生种的分布范围及特点如下：1.
22、 矮牡丹（稷山牡丹 Paeonia jishanensis）：落叶小灌木，高约 6080cm，茎皮带褐色，有纵纹；花通常单瓣，黄、红、紫或白色，花瓣基部无紫斑；当年生枝淡绿色带褐红晕，皮孔不明显；顶生小叶近圆形或宽椭圆形，3 深裂至中部，裂片再浅裂；上表面无毛，下表面被丝毛，后渐脱落；心皮 5，柱头暗紫红色。花期 4 月下旬至 5 月上旬2,9-15。该种主要分布于山西西南部的稷山、永济和陕西西北部的华山、铜川、延安1河南科技大学硕士学位论文等地，生长于阴坡疏林下或沟谷两旁岩石缝中。2. 杨山牡丹（Paeonia ostii）：落叶灌木，高约 1.5m，茎皮灰褐色，呈圆筒形，内卷，皮细肉厚，外
23、部可见纵面剖开的裂缝，断面内白色，粉性足，有特殊浓郁的香气，特称“ 凤丹 ”，是著名的地道药材；雄蕊多数，花药黄色，花丝暗紫红色，花盘暗紫红色；心皮 5，柱头暗紫红色。花期 4 月中、下旬2,9,11,13,15 。该种由秦岭山脉向西分布到甘肃东南部，向南分布到湖北西南部及湖南西北部，向东经河南东南部分布到安徽南部。3. 卵叶牡丹（Paeonia qiui）：落叶灌木，高达 80cm，茎皮灰褐色，具纵纹。二回三出或一回三出复叶，小叶 9 枚，卵形或卵圆形，表面多为紫红色，背面浅绿色，先端钝尖，基部圆形，花单生枝顶，粉色或粉红色，花蕊极短，柱头扁平，翻卷成耳状，多紫红色，花药黄色，花丝粉色或粉红
24、色，花盘暗紫红色，革质，全包心皮，心皮 5，密被白色或浅黄色柔毛，种子卵圆形，黑色而有光泽，花期 4 月下旬至 5 月下旬，果期 8 月2,3,9,11,13,15。该种分布区极为狭窄，至今仅见于湖北神农架山地（松柏和保康）和河南西峡，堵河源自然保护区民主、花坪、白河等地有分布。4. 紫斑牡丹（Paeonia rockii）：落叶灌木，茎直立，高 0.51.5m 。小枝圆柱形，微具条棱，基部具鳞片状鞘；叶通常为二回三出复叶；花大，单生枝端，苞片 5，长椭圆形；萼片 45，淡黄绿色，近圆形，花瓣约 10 枚，白色，卵形，内面基部具有深紫色斑块；花丝淡黄色，花盘黄白色；心皮 58 枚，柱头黄白色；
25、雄蕊多数，黄色；花盘杯状，革质；包围心皮，心皮 57，密被黄色短硬毛；瞢荚密被黄色短柔毛，顶端具喙；种子倒圆锥形，黑色具有光泽。花期5 月，果期 7 月2,3,9,11,13,15-17。该种分布区域比较广泛，主要分布于甘肃南部、陕西秦岭南坡、河南伏牛山以及湖北西部神农架等地，生于海拔 1 1002 800m 的落叶林中。5. 四川牡丹（Paeonia decomposita）：落叶灌木，高 0.51.6m ，各部均无毛，茎皮灰黑色，片状剥落；顶部长尖黄绿色带有晕圈，腋芽短小，稍弯曲，有红晕；当年生枝紫红色，基部具残存芽鳞；叶多为三回或四回三出复叶，顶生小叶卵形或倒卵形，3 裂达中部或近全裂，
26、裂片再 3 浅裂；花单生枝顶，花瓣 912 枚，浅紫至粉红色，花柱短，柱头扁，反卷，幼果无毛，褐带绿色；花丝白色，花盘白色，心皮 4，无毛。花期 4 月下旬至 5 月上旬2,3,9,11,13,15。该种分布范围极为狭窄，仅见于四川西北部马尔康县、松岗、金川大渡河及岷江流域。2第 1 章 文献综述1.1.1.2 青藏高原东部云贵高原分布区青藏高原东部为中亚热带气候向亚热带气候过渡地区，云贵高原为中亚热带西部半湿润气候，分别为山地寒温性针叶林地带和中亚热带常绿阔叶林地带。该区为牡丹组（Sect. Moutan DC.）肉质花盘亚组（subsect. Delavayanae）分布区，由北向南及西南
27、分布着狭叶牡丹、紫牡丹、黄牡丹、大花黄牡丹。其主要野生种的分布范围及特点如下：1. 狭叶牡丹（Paeonia potanini）：亚灌木，高 1.01.5m，茎淡绿色，无毛，叶近对生，二回三出羽状复叶；花红色至紫红色，花外无大形总苞，苞片与萼片57 枚；心皮通常 23 枚，无毛；花瓣 912 枚，花径 56cm；雄蕊多数，花丝红色；柱头细而卷曲，花盘肉质；花期 5 月2,9,11,13,15,18。该种分布于四川西部巴塘、雅江、乾宁、道孚、康定及云南昆明、丽江、嵩明东川一带，生长于河谷坡地、地埂边及林缘地带，呈片状分布。2. 紫牡丹（Paeonia delavayi）：亚灌木，全体无毛，茎高约
28、 1.5m，当年生小枝暗紫红色，草质，小枝基部具数枚鳞片；二回三出复叶；苞片 34，披针形，大小不等；萼片 34，宽卵形，大小不等；花 25 朵，生于枝顶和叶腋，花瓣 912 枚，红至紫红色，花丝深紫色，花盘肉质，包裹心皮约 1/3，顶端裂片三角形或钝圆；心皮 25 枚，无毛，柱头紫色；花期 46 月，果期 69 月2,9,11,15,18 。本种多见于云南西部至西北部（永宁、鹤庆、中甸、大理、剑川、丽江、宁蒗、香格里拉、德钦、贡山），亦分布于四川西南部及西藏东南部海拔在 2 700m3 500m 的山坡、草丛及杂木林中。3. 黄牡丹（Paeonia lutea）：落叶小灌木或亚灌木，茎高 1
29、.01.5m，无毛，木质，灰色；嫩枝绿色，一年生以上枝条表现块状剥落；二回三出羽状复叶，互生，纸质，叶片羽状分裂，裂片披针形，先端锐尖至钝尖，基部下延，全缘或有齿，下面微带白粉；枝端着生花 25 朵，近顶部的 23 个叶腋内也常有花；苞片 36，披针形；萼片 34，宽卵形；花瓣 912，黄色，有时边缘红色或基部有紫色斑块，倒卵形；雄蕊多数；花丝淡黄色；花盘肉质，包住心皮基部，顶端裂片三角状或钝圆；心皮通常 3 枚，锥形；蓇葖革质，顶端长渐尖，向下弯；种子数粒，黑色。花期 4 月下旬至 5 月中旬，910 月果熟9,11,15,18。该种主要分布于西南季风区内的石灰岩土地和玄武岩土地，包括云南中
30、部、西北部及西南部一带，此外还有西藏东南部以及四川西南部，大多生长于石灰岩山地灌丛或疏林下。4. 大花黄牡丹（ Paeonia Lud lowii）：落叶灌木，株型高大，最高可达3河南科技大学硕士学位论文3.5m，枝干丛生，全体无毛；茎皮灰色，片状脱落；二回三出羽状复叶，两面光滑，表面绿色至黄绿色，带有美丽的青铜色；当年生枝草质，长 2530cm，基部具数枚鳞片，黄绿色，偶有红晕；花 34 朵生枝顶或叶腋，花大，黄色；花瓣、花丝与花药均为黄色；苞片 45，萼片 35，花径 10.512.7cm，花盘肉质，黄色，乳突状，心皮 1，少数为 2，光滑无毛，柱头黄色，蓇葖果圆柱形；种子大，暗褐色至黑色
31、，不规则扁圆形；喜光，喜温暖，不耐瘠薄，畏炎热；西藏特有植物。花期 5 月至 6 月上旬，果熟期 8 月2,9,11,15,18。本种原产中国西藏东南部林芝到米林长约 100 km 海拔为 2 7003 300m 的雅鲁藏布江河谷及山坡林缘。1.1.2 我国牡丹栽培品种分布及特点中国牡丹栽培品种根据栽培地区和野生原种的不同6,19-21，可分为 4 个牡丹品种群1,10,15,22；即中原品种群、西北品种群、江南品种群和西南品种群，其主要分布区及特点如下：1. 中原牡丹品种群：本品种群植株高低不一，一般情况下，较其它三个品种群矮；花型种类最为齐全，花色多样，有白、粉、红、紫、墨紫、绿、淡黄、雪
32、青等色和复色，色彩浓淡富于变化，在4个品种群中，花色最为丰富；品种多达 500 多 个 ， 在 4 个 品 种 群 中 数 量 最 多 。 主 要 野 生 原 种 是 矮 牡 丹 （ P.jishanensis）、紫斑牡丹（P. rockii），近年，杨山牡丹（ P.ostii）也参与了中原牡丹品种的形成。中原品种群栽培历史悠久，主要分布于黄河中、下游地区，分布以山东荷泽、河南洛阳和北京为中心，向东已在青岛、烟台，向西在甘肃兰州，向北在长城以南，向南在上海、杭州一线都能正常生长开花；经防寒越冬已在哈尔滨、大庆、牡丹江、尚志以及到青海西宁等地也已栽培；在国外已经引种栽植到日本、荷兰、英国、法国、
33、德国、美国、澳大利亚、意大利、新加坡等国，可见该种群对环境的适应能力很强15,23-26。2. 西北牡丹品种群：该种群品种数量较多，约有 100 多个品种，开花时间较长；植物高大，年生长量较大，叶形变化较少，总叶柄长；花型演化程度较中原品种群低，台阁花品种数量较少；耐寒、耐旱、耐碱，生长旺盛，病虫害少，可 在 寒 冷 、 干 旱 的 广 大 西 北 地 区 种 植 。 其 主 要 野 生 原 种 是 紫 斑 牡 丹 （ P.rockii），也有矮牡丹（P. jishanensis）的血缘。栽培区在兰州、临夏、临洮等地，包括甘肃省渭河中、上游的天水、甘谷、武山、陇西及静宁；大夏河中、下游的夏河、临夏、和政；洮河下游的临洮、康乐以及兰州、榆中等地；陇东的平凉也有较多的栽培。此外西宁及其以东地区、西安及其以西地区和宁夏的固原地4
