1、实验七 聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点,一、目的要求,1.学习和掌握圆盘电泳技术 2.学习和掌握等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点原理和方法,二、原理 蛋白质属于两性电解质，所带电荷的性质与数量与所处环境的pH值有关：环境pHpI，带负电，电场下向阳极移动；环境pH=pI，不带电，电场下不移动。 有一类两性电解质：它具有依次递变而又相差不大的等电点，在电场下形成递变而又连续的pH梯度，故在电泳介质中加入这种物质则能造成介质pH由酸到碱逐步变化。,等电聚焦原理：利用：1)各种蛋白质pI不同2）两性电解质载体在电场作用下，按各自pI形成从阳极到阴极逐渐增加的连续而稳定的pH梯度以聚丙烯酰
2、胺凝胶为电泳支持介质，并在凝胶中加入两性电解质载体，在电场作用下，蛋白质在此pH梯度的凝胶中泳动，当迁移至pH值等于pI处时，就不再泳动，而被浓缩成狭窄的区带。,两性电解质载体(carrier ampholytes) (1)易溶于水，在pI处应有足够的缓冲能力，形成稳定的pH梯度，不致被蛋白质或其它两性电解质改变pH梯度。 (2)在pI处应有良好的电导及相同的电导系数，以保持均匀的电场。 (3)分子量小，可通过透析或分子筛法除去，便于与生物大分子分开。 (4)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，也无变性作用，其化学组成不同于蛋白质。,三、实验试剂与仪器 1）两性电解质 2）30丙烯酰胺溶液
3、3）TEMED 4）10过硫酸铵溶液 5）负极缓冲液：0.1M NaOH 正极缓冲液：0.1M 磷酸或硫酸 固定液：10（W/V）三氯乙酸 染色液 脱色液 蛋白质等电点标准 电泳仪 圆盘电泳槽,图 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图 (A为正面,B为剖面),四、操作方法 1. 凝胶柱的制备 （1）玻璃管的一端插在橡皮帽中 （2）配胶表 10mL 7.5%凝胶的配制 试 剂 名 称 体积(mL) 凝胶贮液 2.5 两性电解质载体 0.5 蒸馏水 6.75 10%过硫酸铵 0.05 10%TEMED 0.1 蛋白质混合样品 0.1 混匀后置真空干燥器中抽气 10 min,（3）将配好的凝胶溶液用细长头滴
4、管加到预先准备好的玻管中，至离上端1 cm处，再用注射器缓缓加水3-5 mm高。 （4）待凝胶聚合 2. 电泳将装有胶的玻管固定到电泳槽上槽的洞中（安装时要保证凝胶管垂直且橡胶塞孔密封不漏）在上槽中装入0.1mol/L氢氧化钠溶液，在下槽中加入0.1mol/L磷酸缓冲液。连接到电泳仪，接通电源，调电压至160 V，聚焦过夜，至电流降为0，则可关闭电源。,3剥胶 电泳结束后，取下凝胶管，用蒸馏水洗净两端电极液，在凝胶条的正极端作上标记。用灌满水的注射器长针头插入凝胶与玻管管壁之间，边压水边慢慢转动玻管，推针前进，同时注入水，靠水流压力和润滑力将玻璃管内壁与凝胶分开，凝胶条即可流出。 4 .固定染
5、色取出凝胶条放在一块洁净的玻板上，用尺量出固定前的凝胶条长度。放入带盖试管中加入固定液。固定20min2后，倒掉固定液后用脱色液漂洗2次，再染色1h，用蒸馏水漂洗数次后用脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰，量出蛋白带距正极端的距离。,5 .蛋白质条带聚焦位置的计算求出蛋白质聚焦部位距凝胶条正极端的实际长度为：蛋白区带中心距凝胶条正极端的距离 固定染色前凝胶条长度固定染色后凝胶条长度,6. pH梯度的制作取已知等电点的标准蛋白聚焦凝胶条放在玻板上，量出各蛋白条带至正极端的实际长度，以条带实际长度为横坐标，对应的pH值为纵坐标，绘制标准pH梯度曲线。,IEF-PAGE测定蛋白质pI,计算出待测蛋白质聚焦部位的实际长度后，直接从pH梯度曲线上求出该蛋白质等电点。,五、思考题 (1)简述聚丙烯酰胺等电聚焦电泳的基本原理。 (2)进行聚丙烯酰胺等电聚焦电泳时的注意事项有哪些？,
