1、,第六章、等电聚焦电泳技术,等电聚焦（isoelectrofocusing, IEF or EF)：,等电点聚焦就是在电场中形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH梯度，不同的蛋白质移动并聚焦于与其等电点相当的pH位置上，从而达到蛋白质的分离目的。,一、基本原理,（1）天然pH梯度的形成：这种梯度是由电流本身所引起并保持的。若将一些两性电解质放入电泳槽中，则它们在阳极的酸性介质中就会得到质子而带正电，在阴极的碱性介质中则失掉质子而带负电，这样带电粒子就会受其附近的电极所排斥而向相反方向移动。设一个酸性最强的两性电解质（甲），当它由阴极逐渐接近阳极时，就会失去电荷而停止运动，（甲）所在的位置就是它的等
2、电点；另有一个等电点稍高于（甲）的物质（乙)，在向阳极运动时，它只能排在（甲）的阴极侧。假如有很多不同等电点的两性电解质，它们将按照等电点从阳极向阴极由低到高的顺序依次排列，形成一个平稳的pH梯度。在防止对流的情况下，只要电流稳定，这个pH梯度将保持不变。,Fig 3.2. Creating a carrier ampholyte pH gradient. (A) No voltage applied. (B) Ampholytes and proteins move by electrophoresis when charged. (C) At isoelectric pH, ampholy
3、tes and proteins are focused.,pH,按等电点大小在pH梯度某一相应位置聚集的行为称为聚焦。,（2）蛋白质的电聚焦分离：蛋白质及多肽是两性电解质，它们在等电点附近仍有电荷而能进行电迁移，在等电点时就失去电荷而停止运动。在有第三种居间的两性电解质存在时可将两种蛋白质完全分开。,等电聚焦的优点： 有很高的分辨率，可将等电点相差0.01-0.02 pH单位的蛋白质分开；电聚焦的分辨率是指能够测定出的两个临近蛋白带的最小pH差，以(pI)表示：,D:蛋白质的扩散系数 E:电场强度,电聚焦能抵消扩散作用，使区带越走越窄； 可直接测出蛋白质的等电点，其精确度可达0.01 pH单
4、位。电聚焦技术的缺点： 电聚焦要求用无盐溶液，而在无盐溶液中某些蛋白质可能发生沉淀； 不适用在等电点不溶或发生变性的蛋白质。,稳定的pH梯度是等电聚焦技术的关键； 特殊的两性电解质可以实现pH梯度。两性电解质：同时带有正、负电基团的化合物。,二、载体两性电解质,1. 载体两性电解质必需具备的条件,（1）在等电点处必需有良好的可溶性； （2）在等电点处必需有足够的缓冲能力； （3）在等电点处必需有良好均匀的导电性；,（4）不同pH值的载体要有相同的电导系数； （5）分子量要小； （6）化学组成应不同于被分离物质，无紫外吸收或吸收较低，不干扰测定； （7）不与分离物质反应或使之变性。总起来说，当一
5、个两性电解质的等电点介于两个很近的pk值之间时，它在等电点的解离度大，缓冲能力强，而且电导系数高，这就是好的载体两性电解质。,1. 载体两性电解质必需具备的条件,等电聚焦中使用的载体两性电解质是含有正负电基团的一类异构体与同系物的混合物。其化学本质是多羧基、多氨基脂肪族化合物。,2. 等电聚焦中使用的载体两性电解质,CH2-N-(CH2)-N-CH2-(CH2) (CH2)NR2 COOH,x = 2 or 3 R = H or (CH2)-COOH,载体两性电解质是由具有几个pH值很相近的多乙烯多胺（如五乙烯六胺），与不饱和酸（如丙烯酸）发生加合反应而进行合成的。调节胺和酸的比例可以合成出多
6、异构物和同系物，以保证很多具有不同而又互相接近的pK值和pI值，从而得到平滑的pH梯度。 常用的载体两性电解质：,载体两性电解质的等电点在pH3-10的范围，分子量在300-1000之间，电导性能良好，可以使电场强度分布较均匀，它们的水溶性良好，在1%水溶液中的紫外吸收值（260 nm）很低。,3. pH梯度的形成,在不加电场时，载体两性电解质溶液的pH值大约是该溶液pH范围的平均值。 当加入电场后，载体两性电解质根据各自的pI值进行分布，低pI的分子向阳极移动，高pI值的分子向阴极移动，直至各自的等电点而停止运动，从而形成pH梯度。 相邻两种分子的两性载体电解质形成的不同pH的等电点层，每一
7、层由于它们的高缓冲能力给予环境一个pH值。两层之间不能形成纯水层，中间部分相互粘连，从而形成平稳的pH梯度。,pH梯度的形成有一时间过程：加入电场后，pH梯度首先在电极两端开始形成，然后移向中间。 在12 cm的凝胶距离中，使用30 W的功率，Ampholine在1 h后，pH梯度才能完全形成，2 h 后变化很小。,4. pH梯度形成的时间效应,阴极,阳极,pH,2,10,8,6,4,距阴极距离(cm),2,6,8,10,12,4,电泳30 min,阴极,阳极,2,10,8,6,4,距阴极距离(cm),2,6,8,10,12,4,电泳1 h,5. TEMED对pH梯度的影响,载体两性电解质本身
8、可以作为凝胶聚合的促进剂，因此在凝胶制备中可以不加TEMED； 如加入TEMED，可促使广泛、中性和碱性范围载体两性电解质凝胶的聚合，对酸性范围无加速作用； TEMED的存在可增加聚丙烯酰胺凝胶pH梯度碱性侧的pH（扩展12 pH单位）。由于CO2的影响，碱性侧的pH往往达不到指定的pH值，因此TEMED的扩展具有实际意义。,三、等电点聚焦中稳定介质的选择,稳定介质是用以防止液体对流保持pH梯度，避免已分离物质再混合的重要措施。 （一）密度梯度密度梯度是由重溶液和轻溶液以梯度混合形成。用做密度梯度的溶质应具有以下条件：溶解度高，粘度低；密度大，得到的密度差不低于0.12 g/cm3，不与样品蛋
9、白质起反应，不解离。最常用的是蔗糖（分析纯）。重溶液含蔗糖50%（W/V)，这时柱上和柱下最大密度差为0.2 g/cm3。蔗糖在高pH值时会分解，影响pH梯度及pI值测定，这种情况下可改用甘油，也可用甘露醇，山梨醇，右旋糖酐等。,（二）固相支持介质,聚丙烯酰胺凝胶 浓度：58； 交联度：3 琼脂糖凝胶 浓度：1 固相凝胶载体常常引起电渗作用，使得形成的pH梯度与两性电解质标明的pH范围有差别： 聚丙烯酰胺凝胶使pH向阴极漂移 琼脂糖凝胶可使pH向阴极漂移约2个pH单位,四、pH梯度的选择,在测定未知蛋白时，可先采用pH3-10的载体，经初步测定后改用较窄的以提高分辨率; 在使用pH7以上或以下
10、范围时，因缺少中性载体，在聚焦过程中载体与电极之间在pH7部位就会形成纯水区带，纯水的电导极低，必须避免此现象。凡使用离开中性的pH范围的载体时应加入相当于0.1载体量的pH6-8或pH3-10的载体。在用pH低于3的范围时，可加有机酸如一氯醋酸，二氯醋酸，甲酸，乙酸，pH离于10时，可补加胺使pH增加到11。,（一）样品处理 电聚焦有高的分辨力，一般样品可以提纯，也可以不提纯，分析上可用来测定混合物中某一成分的相对比例; 有些物质（如核酸）聚焦时会沉淀，应预先除去。 蛋白质应不含盐，或溶于低浓度的缓冲溶液中（如0.01 mol/L Tris-HCl）。盐浓度高时电流大，易发热，而且盐离子迁移
11、至两极产生酸碱，占据了分离的有效部位。 在水或低盐溶液中难溶的物质可以添加1的甘氨酸、2的载体两性电解质或尿素、无离子去垢剂。,五、蛋白质样品处理及分离容量,（二）蛋白质样品分离容量 管状电泳：样品浓度10 mg/ml，加样量30 l; 水平板状电泳：样品浓度0.5-2 mg/ml，加样量5-100 l; 密度梯度等电聚焦： 提高密度可以提高分离容量； 降低电压可使区带变宽，提高容量； 窄的pH梯度范围可以使区带变宽，提高分辨率用110 ml柱时，每一区带蛋白质含量最高可达20-25毫克，由于粗蛋白样品可分为很多区带，所以总量可以加至几百毫克；分离的容量与柱的横载面成正比，用440 ml柱时，
12、可加粗蛋白质5克，每一区带可达一克。,六、等电聚焦电泳的实验操作,（一）胶的制备等电聚焦电泳所使用的凝胶为非解离系统的缓冲体系。 1. 管状电泳操作程序基本同SDS-PAGE,灌约1/2胶,灌样品胶,灌余下的1/2胶,水封,2. 平板状电泳 （1）Ready Gel （2）双层平板模具； （3）平移法：下边玻璃板固定，上边玻璃板平推； （4）自然平铺法,（二）电极液选择,一般采用较强的酸与碱的稀溶液作为电极液； 电极液不能产生挥发性产物； 阳极电极液的pH比选定的pH梯度的低限pH低； 阴极电极液的pH比选定的pH梯度的高限pH高,（二）电泳过程,1. 温度控制 电泳过程控制在低温条件下：4-
13、10 2. 上样样品浓度0.5-2 mg/ml，加样量5-100 l;,样品加到放好的滤纸片上,4. 通电电泳,3.电极条准备,电极条不可太湿！,通电电泳约30 min后，取掉加样滤纸片。,电泳条件设置,（二）电泳过程,一般采用恒定功率，且限定最大电压的方式进行电泳。,（二）电泳过程,建议的电泳条件设置,4. 电泳时间的确定 聚焦电泳时间决定于凝胶的pH范围和电压： pH范围窄，时间长； pH范围宽，时间短； 电压高，时间短； 在等电聚焦电泳中，电流会持续降低，当电流降低至最低时（几乎为0），聚焦结束。,（三）pH梯度测定,1. 表面电极测定：每间隔1 cm测定一数据 2. 胶条切割测定： 圆
14、盘电泳凝胶柱每间隔1 cm进行切割 平板电泳沿正负极方向切割一胶条，然后对切割的胶条每间隔1 cm进行切割 将以上切割的小胶条（柱）放在1 ml的蒸馏水中进行浸泡，测定各浸泡液的pH。 3. 标准蛋白标定法：标准蛋白与样品蛋白同时电泳。,（四）样品等电点测定与结果分析,样品等电点测定 以胶长为横坐标，以pH为纵坐标，做出 pH梯度曲线； 测定样品蛋白点距离阳极的位置距离； 在pH梯度曲线上查出相应的pH值。 2. 活性分析 3. 凝胶的固定、染色、脱色、保存基本同SDS-PAGE,固定是必须的。,七、等电聚焦常出现的故障与原因,八. 电泳中的新技术,（一）双向电泳的技术流程 双向聚丙烯酰胺凝胶
15、电泳(two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis，2-D PAGE). 双向凝胶电泳的原理: 第一向进行等电聚焦分离，蛋白质沿pH梯度进行分离，至各自的等电点； 第二向在沿垂直的方向进行按分子量的不同用SDS-PAGE分离,通过双向电泳把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。每个蛋白质组分在电泳图谱中为一个蛋白点。 近年来双向电泳技术经过多方面改进已成为研究蛋白质组的最有使用价值的核心方法。,一维固相pH梯度等电聚焦（IEF with IPG）：,在第一向等电聚焦过程中应用固相化pH梯度， （immobilizer pH gradi
16、ents，IPG）方法，通过这种方式生成的IPG不会发生电渗透作用， 克服了电泳过程中pH梯度不稳等问题，很大程度上提高了2-D PAGE的可靠性和可重复性。因而可以进行特别稳定的IEF分离，达到真正的平衡状态。,两维间的平衡,一维结束后可马上进行二维电泳，也可保存在两片塑料膜间于80保存数月。 但在二维电泳前一定要进行胶条的平衡，以便于待分离的蛋白质与SDS充分结合，从而在SDS-PAGE中使电泳能顺利进行。,二维SDS-PAGE,同普通SDS-PAGE类似。 但一般在垂直电泳系统中无需浓缩胶，因为在IPG胶条中蛋白质区域已得到浓缩，可以认为非限制性IEF胶（低浓度丙烯酰胺胶）充当了浓缩胶。
17、,SDS-PAGE,IEF,生物学问题的提出,实验模型的设计,实验组和对照组样品的制备,蛋白样品的IEF和PAGE电泳分离,图像扫描和初步分析,感兴趣蛋白点的切取,胰酶对脱色后蛋白质的消化,质谱的多肽指纹图、微测序分析,质谱结果的生物信息学分析和比对,新蛋白质的发现,其它实验的进一步验证,蛋白信息的初步获得,（二）毛细管电泳,高效毛细管电泳（High Performance Capillary Electrophoresis，缩写为HPCE） 高效毛细管电泳是指溶质以电场为推动力，在毛细管中按淌度差别而实现的高效、快速分离的新型电泳技术。 高效毛细管电泳技术已经成为现代生物物质分离分析的强有力
18、的工具。,HPCE的特点：,和传统电泳技术及现代色谱相比，HPCE的突出特点是： 操作方便，易实现自动化； 分离效率高，分析速度快； 操作模式多，分析方法开发容易； 样品消耗少； 应用范围广。,电泳在内径为2575 m的弹性石英毛细管中进行，管内填充缓冲液或凝胶； 高电压（1030 KV）加在毛细管两侧，产生高电场强度（100500 V/cm）； 可减少焦耳热产生： 毛细管直径细，表面积与体积比大，易于散热 毛细管的高电阻限制了电流的产生和管内产热； 分辨率高，理论塔板系数可高达100,000以上； 检测在毛细管上进行； 物质的分离在水相介质中进行,HPCE的基本原理：,电渗在毛细管电泳中的作
19、用,电渗是固体表面电荷产生的双电层在外加电场作用下引起固体表面液体相对固体的整体流动。 毛细管内电渗的独特的性质是具有平头电渗流。这种平面流形的电渗流使得流动的推动力在毛细管中均匀分布，使得截面的流速相同，可以克服机械推动所产生的抛物面流形对区带的加宽作用。,电渗的平面流形,泵推动的抛物流形,检测到的区带分布,检测到的区带分布,毛细管电泳的操作模式,毛细管区带电泳胶束电动色谱毛细管凝胶电泳毛细管等电聚焦毛细管等速电泳,第七章 蛋白质的氨基酸组成与N-末端分析,氨基酸组成分析是蛋白质化学的主要内容之一。是蛋白质氨基酸顺序测定工作中的主要的前期工作。 最有效的氨基酸分析是以离子交换色谱为基础研制的
20、氨基酸自动分析仪。,一、氨基酸自动分析的原理,分离依据：离子交换原理 分离用离子交换树脂：磺酸型离子交换树脂； 常用Na型，常用X-SO3Na+表示 在进行氨基酸分离时，使氨基酸全部质子化（氨基酸全部带有正电荷）； 在洗脱时，逐步增加洗脱液的pH； 从层析柱中洗脱下来的氨基酸与另一管路的茚三酮混合，经加热后发生显色反应；,呈色反应的深浅与氨基酸的含量成正比； 记录仪以洗脱峰的形式记录分析结果： 每一峰代表一氨基酸； 峰的面积代表氨基酸的含量； 样品的定性与定量是通过与标准的氨基酸混合液的分离结果进行比较进行鉴别与计算,日立83550型氨基酸分析仪的氨基酸洗脱顺序： AspThrSerGluPr
21、oGlyAlaCysValMetIleLeuTyrPheLysNH3HisArg,二、氨基酸样品的水解,氨基酸组分的测定需要对蛋白样品进行水解，使氨基酸残基以游离氨基酸的形式存在。 （一）盐酸水解： AR级盐酸，必要时重蒸三次； 蛋白质浓度：0.5-2.0 mg/ml 对氨基酸的破坏： Trp 全部被破坏； Ser和Thr破坏510； Met破坏20,操作步骤： 固体蛋白样品 6 N HCl 液体蛋白质样品（含巯基乙醇） 12 N HCl (等体积）,冰浴，充氮，封管,110 ，24 hr,冷却，开管，蒸发水份与盐酸,适当缓冲液溶解，定容，上机,（二）磺酸水解：,4 N甲基磺酸，含0.2%色胺
22、（Trp保护剂）,操作步骤：蛋白质样品（含巯基乙醇） 8 N甲基磺酸(等体积）,冰浴，充氮，封管,115 1 ，24 hr,冷却，开管，3.5 N NaOH 中和,离心，过滤，上机,含有糖的样品不适宜于以此方法，,（三）碱水解：,碱水解过程中大部分氨基酸被破坏，并使所有的氨基酸消旋，只有色氨酸较稳定，因此碱水解通常只用来测定色氨酸。,操作步骤：蛋白质样品 10 N NaOH (等体积）,冰浴，充氮，封管（塑料管）,110 1 ，24 hr,冷却，开管，6 N HCl 中和,离心，过滤，上机,（四）部分氨基酸含量的校正,内标法：以已知量的氨基酸经上述水解过程处理，分析仪上测定后，计算回收率作为内
23、标，然后计算样品中的氨基酸含量。 外推法：对同一样品，采用不同的水解时间，分部测定其氨基酸含量，然后以氨基酸含量对水解时间作图，水解的曲线外推至水解时间为0时的氨基酸含量值。, mol 氨基酸,Leu,Thr,Ser,常用的方法： FDNB法 (2,4-二硝基氟苯法); DNS法(二甲氨基萘磺酰氯法) PTH法(异硫氰酸苯酯法)；,三、 N-末端分析,O2N,NO2,F,+ H2N-CH-C-N-CH-C-CH-COOH,O,Rn,H,R1,R2,O,FDNB,室温，pH 8-9,O2N,NO2,HN-CH-C-N-CH-C-CH-COOH,O,Rn,H,R1,R2,O,DNP-蛋白质,105
24、，HCl水解,HF +,O2N,NO2,NH-CH-COOH,R1,H2N-CH-COOH,R2-n,+,DNP-氨基酸,（黄色）,双向层析检测分析,乙醚抽提,FDNB法,DNS法,CH3,CH3,N,+ H2N-CH-C-N-CH-C-CH-COOH,O,Rn,H,R1,R2,O,SO2Cl,pH 9.7,CH3,CH3,N,SO2,-HN-CH-C-N-CH-C-CH-COOH,O,Rn,H,R1,R2,O,CH3,CH3,N,SO2,HCl水解,NH-CH-COOH,R1,H2N-CH-COOH,R2-n,+,DNS-氨基酸,聚酰胺薄膜层析,Edman 降解法 (PTH法）,N=C=S,
25、+ H2N-CH-C-N-CH-C-CH-COOH,O,Rn,H,R1,R2,O,PITC,50，pH 9.0-9.5,NH-C,-HN-CH-C-N-CH-C-CH-COOH,O,Rn,H,R1,R2,O,少一个氨基酸的PTC-肽,S,无水TFA,+ H2N-CH-C-N-CH-C-CH-COOH,O,Rn,H,R2,R3,O,NH-C,N-C-H,R1,S-C=O,N,C-N-H,R1,C-C-H,1N HCl,80 ,S,O,PTH-氨基酸,三、 N-末端分析,N末端氨基受封闭时的末端测定： N末端氨基受封闭常见的情况: 氨基被甲酰化; 氨基被乙酰化; 谷氨酸内酰胺化（焦谷氨酰化）焦谷氨
26、酸（pyroglutamic acid, PYG） 糖基化 烷基化 N末端氨基受封闭不仅可以发生在体内，也可以发生在体外蛋白质的抽提、PAGE、电转移。,N末端乙酰化、甲酰化氨基酸的去封闭,具有N末端乙酰丝氨酸、乙酰苏氨酸的蛋白质可以用三氟乙酸熏蒸法脱乙酰。PVDF膜在三氟乙酸蒸气中60 保温30 min 其它氨基酸的乙酰化不能去封闭 N-乙酰化蛋白质的酶法去封闭： 乙酰氨基酸释放酶可直接作用于PVDF膜上的蛋白质 N末端甲酰化蛋白质的去封闭： 经乙腈浸湿的PVDF膜在0.6 mol/L HCl中25 保温24 h,N末端是焦谷氨酸残基的末端测定： 酶降解法：焦谷氨酰氨肽酶，专一性裂解肽链N-末端的焦谷氨酰残基：,N,O,C-C-N-C-R,O,H,焦谷氨酰氨肽酶,N,O,C-C-OH,O,+ H2N-C-R,少一残基的肽链,化学降解法：,N,O,C-C-N-C-R,O,H,1 N HCl/甲醇,NH2,O,C-C-N-C-R,O,35，48 h,O CH3,H,开环后-羧基变成了甲基酯，但暴露的-氨基可以被Edman试剂偶合，按正常程序降解。 开环率90 徐秀璋：蛋白质顺序分析，科学出版社； 生物化学与生物物理进展，“用化学法降解肽链N末端被封闭的残基及其鉴定”，1985,
