1、基因工程实验报告姓名：杜琳颖 学号：2017051141 学院：生命科学院 专业：生化与分子1、实验目的学习并掌握从目的基因克隆到蛋白质表达的实验流程及原理。2、实验流程实验一、质粒提取载体 DNA 提取及酶切鉴定1、实验目的学习质粒的酶切及电泳分析。2、实验原理质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，具有双链闭环结构的 DNA 分子。它具有自主复制能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。目前，经人工改造的质粒已广泛用作基因工程中目的基因的运载工具载体。质粒 DNA 的提取是依据质粒 DNA 分子较染色体 DNA 分子小，且具有超螺旋共价闭合环状的特点，从而将质粒 DNA 与
2、大肠杆菌染色体 DNA 分离。现在常用的方法有：碱裂解法、密度梯度离心法、煮沸裂解法等。实验室普遍采用的碱裂解法具有操作简便、快速、得率高的优点。其主要原理：利用染色体 DNA 与质粒 DNA 的变性与复性的差异而达到分离的目的。在碱变性条件下，染色体 DNA 的氢键断裂，双螺旋解开而变性，质粒 DNA 氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当 pH=4.8 的乙酸钠将其 pH 调到中性时，变性的质粒 DNA 又恢复到原来的构型，而染色体 DNA 不能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力密度不同，染色体 DNA 与大分子 RNA、蛋白质-S
3、DS 复合物等一起沉淀下来而被除去。限制性内切酶可以识别双链 DNA 特定位点，并产生特异的切割，形成粘性末端或平末端，这样有利于 DNA 片段再连接。限制性内切酶对环状质粒 DNA 有多少切点，酶切后就能产生多少个片段。因此，鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断切点的数目；从片段迁移率的大小可以判断酶切片段大小的差别。用已知相对分子量DNA 为对照，通过电泳迁移率的比较，可以粗略地测出分子形状相同的未知 DNA 的相对分子质量。3、实验材料、仪器及试剂（1）实验材料含载体质粒 pET28a 的大肠杆菌（2）试剂1、LB 液体培养基2、质粒提取试剂盒(天根生物科技)3、TBE 缓冲液
4、4、点样缓冲液 Loading buffer（10）5、琼脂糖6、Nco酶， Xho酶 (Takara)7、DNA 回收纯化试剂盒（天根生物科技）（3）仪器1、Eppendorf 管、离心管架2、10，50，200，1000 L 微量加样器3、Eppendorf 台式高速离心机4、电泳仪系统5、恒温水浴箱6、凝胶成像仪7、摇床等4、实验步骤（一）质粒提取1、柱平衡步骤：向吸附柱 CP3 中（吸附柱放入收集管中）加入 500L 的平衡液BL，12,000rpm 离心 1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。2、取 1.5 mL 过夜培养的菌液（已备好），加入 1.5mL 离心管中
5、，使用 12,000rpm离心 1min，尽量吸除上清，再收集一次菌体（根据浓度选择）。3、向留有菌体沉淀的离心管中加入 250L 溶液 P1（请先检查是否已加入 RNaseA），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。4、向离心管中加入 250L 溶液 P2，温和地上下翻转 6-8 次使菌体充分裂解。5、向离心管中加入 350L 溶液 P3，立即温和地上下翻转 6-8 次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm 离心 10min，此时在离心管底部形成沉淀。6、将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱 CP3 中（吸附柱放入收集管中），注意尽量不要吸出沉淀。12,000rpm 离
6、心 1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱 CP3 放入收集管中。7、向吸附柱 CP3 中加入 600L 漂洗液 PW（请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm 离心 30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱 CP3 放入收集管中。重复漂洗一次。8、将吸附柱 CP3 放入收集管中，12,000rpm 离心 2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。9、将吸附柱 CP3 置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加 50L 洗脱缓冲液 EB，室温放置 2 min，12,000rpm 离心 2min 将质粒溶液收集到离心管中。（2）琼脂糖凝胶电泳法检测提取的质粒 DNA吸取 4L
7、 所提质粒，加入 2L loading buffer 混匀后点样至 0.8%琼脂糖凝胶中，电泳 20min 左右后拿出放入凝胶成像系统，根据图像判断所提质粒浓度及质量。（3）质粒载体 DNA 酶切1、按下表将各种试剂分别加入每个 Eppendorf 管中。2、加样后混匀，置于 37水浴中，保温 5 h。3、吸出 8L 酶切产物，加入 2L loading buffer 混匀后点样琼脂糖凝胶电泳，鉴定酶切是否正确，两个酶切位点之间片段大约 150bp 左右，理论上双酶切电泳应出现两条带，一条较亮的长片段和一条很暗的小片段。而单酶切只出现一条带，即线性化载体。同时应点样质粒作为阳性对照。4、确认酶
8、切正确后，在酶切产物中加入 loading buffer 终止反应，准备胶回收。（4）载体片段的获得1、取酶切产物经琼脂糖凝胶电泳检测确认酶切完全后，然后进行载体片段的回收。2、制备胶回收的琼脂糖凝胶。3、将双酶切样品加入点样空中，进行电泳分离。4、将凝胶板染色后，在凝胶成像仪中切取 DNA 大片段。5、柱平衡步骤：向吸附柱 CB2 中加入 500L 平衡液 BL，12,000rpm 离心 1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。6、将单一的目的 DNA 条带从琼脂糖凝胶中切下放入干净的 离心管中，称取重量。7、向胶块中加入等倍体积溶胶 PC，50水浴放置 10 min，其间
9、不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。8、将上一步所得溶液加入一个吸附柱 CB2 中，12,000rpm 离心 1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱 CB2 放入收集管中。9、向吸附柱中加入 600L 漂洗液 PW，12,000rpm 离心 1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱 CB2 放入收集管中。重复漂洗一次。10、将吸附柱 CB2 放回收集管中，12,000rpm 离心 2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱 CA2 置于室温放置数分钟，彻底地晾干。11、将吸附柱放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加 35L 洗脱缓冲液EB，室温放置 2min。12,000rpm 离心
10、2min，收集 DNA 溶液，此就为连接所用载体Vector。5、实验结果及分析1. 质粒提取检测结果由此结果可知，质粒提取的质量比较好，且浓度也比较高。可以作为下一步酶切的模板。2. 载体双酶切结果由于未点样质粒对照，且单酶切条带离双酶切较远，不好比较，故此次结果不能充分说明载体切开。但从图上来看，11,12,13,14 泳道很可能是未切开的载体，而1,2,3,4,5,6,7,8 泳道的产物与其相比可判断为已切开的载体。此外，此图上未能看到两个酶切位点间的大约 150bp 左右的小片段，可能是浓度太低亮度不够，也可能是由于片段太小已跑出凝胶。所以，先将 1-8 泳道的酶切产物胶回收，拟与回收
11、的目的基因连接转化，通过后来的菌落 PCR 鉴定是否正确。另外，此次试验酶切做了两次，第一次结果如下图：很明显看出有三条带，同样，由于没有质粒对照，不好说明最上面是切开的还是未切开的载体，但通过底下两条带可以推断出，此质粒可能有问题。其载体上两个酶切位点有可能并非一个，除了我们预计的那两个，可能序列中还存在同样的酶切位点，所以导致酶切产物出现多条带的现象。故更换实验材料重新提取质粒和做双酶切。实验二、目的基因的获得及酶切处理1、实验目的1、学习 PCR 反应的基本原理和实验技术。2、了解引物设计的一般要求。3、掌握 PCR 产物的回收及酶切过程2、实验原理聚合酶链反应（polymerase c
12、hain reaction，PCR ）是体外酶促合成 DNA 片段的一种技术。利用 PCR 技术可在数小时之内大量扩增目的基因或 DNA 片段，以用于基因工程操作。PCR 进行的基本条件：DNA 模板引物dNTP（dATP、dTTP 、 dGTP、dCTP ）Taq DNA 聚合酶反应缓冲体系PCR 循环由三个步骤组成：变性 使模板 DNA 解离成单链；退火 使引物与模板 DNA 所需扩增序列结合；延伸 DNA 聚合酶利用 dNTP 合成与模板碱基序列互补的 DNA 链。每一个循环的产物可作为下一个循环的模板，通过 30 个左右循环后，目的片段的扩增可达 106 倍。3、实验仪器及试剂（1）仪
13、器Premix EX Taq DNA 聚合酶10反应缓冲液（含 25mmol MgCl2）引物 F1: 5-CATGCCATGGGCGAGGGCAAAGCCCGCAC-3 ；R1:5-CCGCTCGAGTCAGACATAAGAAAAGCCATTGG-3Nco酶，Xho 酶 (Takara)胶回收试剂盒（天根生物科技）DNA 模板（2）试剂PCR 扩增仪等4、实验步骤（1）PCR 扩增1、按下表加入试剂，并小心混匀。2、设置 PCR 程序并运行：（2）PCR 产物鉴定反应结束后，取 5L PCR 产物进行 1 %琼脂糖电泳分析。（3）目的基因片段的回收步骤同载体片段回收。（4）目的基因片段的酶切
14、加样后混匀，置于 37水浴中，保温 712 小时。然后每个管中加入 Loading buffer终止反应。（5）目的基因片段酶切后回收同载体片段回收的步骤进行。此为 Insert，为连接做好准备。5、实验结果及分析1. 目的基因的获得目的基因为 VP60，是兔出血热病毒外壳蛋白，目的片段大约 1700bp 左右，点样所用的 Marker 为 DL2000。从图上看出，PCR 产物大小位于 2000 偏下一些，大致与目的基因大小一致。可以说明目的基因获得正确。由于引物设计加了酶切位点，所以该产物序列两端带有两个酶切位点，便于下一步酶切回收后与载体连接转化。实验三、质粒载体和外源 DNA 的连接及
15、转化1、实验目的1、掌握 DNA 体外连接的基本技能，了解连接反应的注意事项。2、掌握感受态细胞制备和转化的基本方法。2、实验原理DNA 片段之间的连接是通过 DNA 连接酶的催化实现的。DNA 连接酶催化具有平末端或互补粘性末端的 DNA 片段间相邻碱基通过 3-5磷酸二酯键连接起来，该反为需能反应，通常需要加入 ATP 或 NADH，DNA 连接酶对粘性末端的连接效率要远高于对平末端的连接效率。在基因基因工程实验中，最常用的来源于 T4 噬菌体的 T4DNA 连接酶。对于平末端或互补的粘性末端可直接进行连接反应。一个片段是平末端，另一片段为粘性末端或两个片段都是粘性末端但不配对，则需要通过
16、各种方式使其可一匹配或通过平末端进行连接。通常采用末端补平、加同聚物尾、加接头等方式是目的片段之间能够匹配。进行连接反应时，为了减少片段的自连，通常要进行去磷酸化，去磷酸化可通过碱性磷酸酶完成。比如将目的片段和载体进行时通常要将载体去磷酸化，以减少载体的自连。同要进行连接反应也经常对目的片段进行磷酸化以增强目的片段的连接，在相邻碱基间如果没有磷酸在连接效率大幅下将，如果载体进行了去磷酸化，目的片段可进行磷酸化，以增强目的片段和载体的连接。在连接反应中，目的 DNA 片段和载体的比例是一个关键问题，对于长度为 1kb 的片段和 3kb 的载体而言，通常目的片段和载体的比例设为 2：1 或3：1，
17、如果目的片段越长该比例应再升高，因为主要考虑的是载体和目的片段之间的分子数的比例。反应体系中核酸的浓度也是一个重要问题，通常反应体系中反应物浓度应保持在 25 -100 ng/L。连接反应和其它酶不同，需要在较低的温度下进行，通常在 1216过夜，也可在 4过夜连接，如果是平末端连接，可适当提高连接温度。除上述因素外，DNA 样品的纯度、盐浓度等会影响连接效率。所谓感受态细胞是通过一定的试剂处理细胞，使细胞处于易于接受外源DNA 的生理状态。通常用 0.1M CaCl2 处理细胞，就可得到感受态细胞。细胞原本所处的生理状态制备对感受态细胞的制备很关键。将重组 DNA 导入细胞的方法有多种，如热
18、休克法，电击法等。通过这些方法可以使细胞膜出现暂时的松弛，导致外源 DNA 进入细胞。3、实验材料、仪器及仪器（1）材料大肠杆菌 DH5 菌株（2）仪器1、冷冻离心机2、恒温水浴3、微量移液器4、无菌操作台5、电子天平（3）试剂1、目的 DNA 片段 (Nco/Xho)2、载体（pET-28a Nco/Xho）3、T4 DNA 连接酶（Thermo）4、ddH 2O5、0.1mol/L CaCl 2 6、LB 液体培养基7、LB 固体培养基8、卡那霉素（100 毫克/毫升）4、实验步骤（一）连接取一个 200L 的 PCR 管依次加入下列试剂：使反应体系充分混合，离心 30s，37连接 20,
19、min。（二）感受态细胞的制备(0.1M CaCl 2 方法)1、取 1.5ml 摇好的菌液于 1.5 mL 的 EP 管中， 4 4000rpm 离心 3min，弃上清。2、加 250L 0.1M CaCl2（预冷）温和悬浮菌体，4 8000rpm 离心 1min 弃上清。3、加 100 L 0.1M 的 CaCl2（预冷）温和悬浮菌体，即为感受态细胞。置于 4 存放。12h 内使用效果最佳。（三）连接产物对大肠杆菌的转化1、1、将连接产物全部加入 100L 制备好的感受态细胞中。2、冰上放置 10min。3、42热激 90S。4、冰浴 3min。5、加入 800L LB 液体培养基，37培
20、养复苏 60min。6、离心浓缩后，留下大约 100L 悬起细胞，超净台中涂布于含有卡那霉素的平板上。7、37倒置培养 16-20 h。5、实验结果及分析本次转化结果不是很好，平板上过夜长的菌都比较小且很少，可能是连接效果不好，也可能是转化所用感受态细胞活力不高。故将所有的单克隆都挑出，放入 LB 培养基中扩大培养，注意做好标记。然后吸出少量菌液进行菌落 PCR鉴定，而后提取重组质粒进行酶切鉴定，通过鉴定结果判断单克隆是否正确。实验四、重组质粒鉴定及转化1、实验目的掌握快速细胞破碎法测定大小不等的众多的质粒 DNA；和菌落 PCR 快速鉴定克隆。2、实验原理在这个实验方法中，用设计好的引物，做
21、菌落 PCR 快速鉴定克隆；然后将有扩增信号的菌落经培养后提取质粒，再进行酶切进一步鉴定；最终将确定好的重组子转入表达菌株中。3、实验材料、仪器及试剂（1）材料大肠杆菌菌株 BL21（DE3）；BL21（DE3）plysiS（二）仪器1、电泳仪2、1.5ml 离心管3、培养皿4、PCR 扩增仪5、 台式离心机6、 凝胶成像仪（三）试剂1、 点样缓冲液 Loading buffer（10）2、 2Mix Taq DNA 聚合酶3、 TBE 电泳缓冲液（5）4、引物 F1: 5-CATGCCATGGGCGAGGGCAAAGCCCGCAC-3 ；R1: 5-CCGCTCGAGTCAGACATAAGA
22、AAAGCCATTGG-35、卡那霉素（100 毫克/毫升）6、Nco酶， Xho酶 (Takara)4、实验步骤（一）菌落 PCR 快速鉴定法1、直接用牙签或接种针挑取少许菌体加入 1.5mL LB 液体培养基中 37摇约3h。2、吸取 1L 菌液作为模板加入 20L PCR 体系中（剩余菌液继续摇）：设置 PCR 程序：3、运行 PCR 程序4、反应结束后，取 5LPCR 产物进行 1 %琼脂糖电泳分析。（二）重组质粒酶切鉴定1、重组质粒提取挑取菌落 PCR 鉴定的阳性克隆，进行培养后提重组质粒，重组质粒提取参见前述质粒提取的方法和步骤。2、重组质粒的酶切鉴定按下表将各种试剂分别加入每个
23、200l 的 Eppendorf 管中。加样后混匀，置于 37水浴中，保温 56 h。然后进行琼脂糖电泳分析。（三）重组质粒的转化用重组质粒转化表达菌 BL21（DE3）和 BL21（DE3）pLysS，感受态的制备及转化参考实验三进行。BL21(DE3)pLysS 菌株携带 pLysS 质粒，具有氯霉素抗性。pLysS 含有表达 T7 溶菌酶的基因，T7 溶菌酶可以作用于大肠杆菌细胞壁上的肽聚糖溶解大肠杆菌,，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰 IPTG 诱导的表达，适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。该菌株染色体整合了 噬菌体 DE3 区(DE3 区含有 T7 噬菌体 RNA 聚合酶)。B
24、L21(DE3)是大肠杆菌表达菌株，用于高效表达克隆于含有噬菌体 T7 启动子的表达载体（如 pET 系列）的基因，是以 T7 RNA 聚合酶为表达系统的高效外源基因的蛋白表达宿主，T7 噬菌体 RNA 聚合酶基因的表达受控于 噬菌体 DE3 区的 lacUV5 启动子，该区整合于 BL21 的染色体上。该菌株适合于非毒性蛋白的表达。5、实验结果及分析1. 菌落 PCR 鉴定由上图可以看出，大部分单克隆菌是可以扩出目的基因条带的，说明连接转化成功，故可将扩大培养菌液中菌落 PCR 鉴定正确的菌液保留提取质粒，不正确的丢弃。2. 重组质粒酶切鉴定重组质粒酶切鉴定，预计结果应是：双酶切切出两条带，
25、分别是目的基因和载体，单酶切只是线性化质粒，只有一条带。加上质粒对照进一步说明酶切结果的可信度。上图结果说明，重组质粒正确，可硬用于下一步的转化表达菌株进行 IPTG 诱导蛋白表达。3. 转化此次转化结果较上次好一些，单克隆很多且菌落比较大。可以用于下一步蛋白诱导。实验五、目的蛋白的诱导及表达一、实验目的1.学习用诱导物诱导外源基因表达；2.掌握 SDS-PAGE 原理和技术，3.应用于基因工程产物的分析鉴定。二、实验原理SDS-PAGE（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophpresis）是目前用于测定蛋白质分子量的一种最好方
26、法。该技术在 1967 年由 Shapiro 等建立，此方法用于多肽分子量的测定，变性蛋白的分离，和溶解在离子去污剂中的膜蛋白和层析分离的蛋白和酶的纯化控制。SDS 是一种阴离子去污剂，作为蛋白的变性剂和助溶剂，它能断裂多肽分子内和分子间的氢键，破坏蛋白的二级，三级结构，使的多肽链失去天然构型折叠。强的还原剂例如巯基乙醇（-mercaptoethanal）或者二硫苏糖醇（dithiothretol,DTT）多肽链间和链内的二硫键断裂。当样品和凝胶中加入还原剂和 SDS 后，分子解聚并结合 SDS，形成蛋白质 -SDS 胶束，带有大量负电荷的 SDS 掩盖了蛋白质本身所带电荷，这一胶束在水溶液中
27、，短轴对不同蛋白亚基均为，18A O；而长轴则与亚基分子量大小成正比。根据经验所得，当 SDS 的浓度在 810-4 mol/L 以上时， 1g 蛋白质几乎恒定的结合 1.4g 的 SDS。当处理好的样品进行 SDS-PAGE 时，不同亚基将根据所带负电荷和和凝胶介质的分子筛效应而相互分离，其中浓缩胶和分离胶，PH 值的不连续凝胶系统使的各亚基得到更好的分离。3、试剂与仪器（1）试剂1、标准分子量蛋白溶液2、Tris-Gly 电极缓冲液： Tris 6g,Gly 28.8g，SDS 1g，ddH2O 溶解后，用HCL 调 PH 至8.3,水定容至 1000 mL。3、30%(w/v)凝胶贮存液
28、： Acr 30g,Bis 0.8g 加蒸馏水溶解至 100 mL。过滤，棕色瓶 4保存。4、Tris-HCL 分离胶缓冲液 (3mol/L pH8.7)：Tris 36.3g, 1 mol/L HCL 48 mL,加 ddH2O至 100 mL。5、Tris-HCL 浓缩胶缓冲液 (0.5mol/L pH6.7)：Tris 5.98g, 1 mol/L HCL 48 mL,加ddH2O 至 100 mL。6、10%SDS： 1g SDS 加水 10 mL 溶解。7、10% 过硫酸铵（AP）： 1g AP 加水 10 mL 溶解 （现配）。8、四甲基乙二胺（TEMED）4 棕色瓶中贮存。9、样
29、品处理液： Tris-HCL 浓缩胶缓冲液 20 mL, -巯基乙醇 10ml,SDS 2g，甘油 20 mL，溴酚蓝 0.1g，加 ddH2O 至 100 mL。10、0.05%(W/V) 考马斯亮蓝染色液： 考马斯亮蓝 R-250 0.5g 异丙醇 250 ml，冰乙酸110ml，蒸馏水 740 mL。11、脱色液：异丙醇 100 mL，冰乙酸 100 mL，蒸馏水 800 mL。12、标准分子量蛋白溶液13、卡那霉素（100 毫克/毫升）14、IPTG（1M，0.1M）15、LB 液体培养基（2）仪器1、 稳压稳流电泳仪2、 垂直板电泳槽3、 烧杯（50mlx2）4、 脱色摇床5、 台式
30、高速离心机6、 恒温摇床7、 无菌操作台（含酒精灯、）4、 实验步骤（一）目的蛋白的诱导1、分别挑取空载菌和重组菌菌落，接入 5ml 含 Kan（50g/ml）的 LB 培养液，37振荡培养过夜，同时设置空菌对照，接入不含 Kan 的 LB 培养基作为空白对照。2、取 5ml 过夜培养物接入 500ml 含 Kan（50g/ml）的 LB 培养液，37振荡培养 2h 左右，至对数中期（OD600=0.50.6 ）。3、向诱导管中加入 0.1 和 1M 的 IPTG，同时设置不加 IPTG 的阴性对照管，25振荡培养过夜。（二）SDS-PAGE 检测目的基因的表达1、将制胶装置固定在制胶架上。2
31、、按照下表配制分离胶。（注意 TEMED 和 APS 最后加，防止凝胶）将分离胶注入玻璃夹层中。上部 25%乙醇或蒸馏水封面，保持胶面水平，待分离胶聚合好，再配制浓缩胶。3、配制浓缩胶（4%。15ml）灌入浓缩胶，插入梳子。胶凝固后待用。点样前再拔掉梳子。4、样品处理收集过夜诱导的菌液，10000rpm 离心 1min 收集菌体，而后倒掉上清，加入 200L 的蒸馏水混匀后，加入 loading buffer，100 水浴 5 分钟，然后插入冰浴冷却后离（10000r/min.5min）,取上清备用。5.加样电泳槽中加入电极缓冲液，拔掉点样梳，用微量进样器点样，上样量40L，蛋白 Marker
32、9L。点样顺序按照：Marker、DE3 空菌+IPTG、pET28a 空载+IPTG、pET28a-IPTG、 重组质粒 5DE3-IPTG、5DE3+IPTG、 18DE3-IPTG、 18DE3+IPTG、 19DE3-IPTG、19DE3+IPTG。6、电泳接好电路，打开电源，在低电压 100V 下电泳，至样品在浓缩胶部分聚集成线，改用电压 140V 电泳，待溴酚蓝前沿到达凝胶底部时停止电泳。7、剥胶和染色倒掉电极缓冲液，轻轻敲开玻璃板，取出凝胶并在角上做好记号（注意不要污染了凝胶）；用蒸馏水洗涤凝胶；然后将凝胶置于染色液中，振荡染色 2 小时。8、脱色取出凝胶，先用蒸馏水漂洗数次，然
33、后置于脱色液中振荡脱色至背景干净，条带清晰。9、照相保存5、实验结果及分析目的蛋白大小为 60KD 左右，本次蛋白胶结果不好，可能由于上清较为粘稠（尽管已经离心），但没有过柱子进一步纯化，导致上样样品较粘；且点样时存在飘样情况，这对于胶图结果也有影响。空载泳道在目的蛋白区无明显条带，符合预期结果，但其他泳道加 IPTG 诱导和未加 IPTG 诱导区分不是很明显，理论上未加 IPTG 诱导应该无目的蛋白或含量极少，这有可能是由于点样时产生的飘样，也可能表达的蛋白未经纯化浓缩，导致胶图上出现很多杂带。从上图来看，66KD-45KD 区域有蛋白条带，但量不是很大，也可以初步判断目的蛋白表达。如果要进
34、一步确认目的蛋白的表达及其表达量，则可以进行 western blot 验证，将蛋白胶转膜后采用目的蛋白的特异抗体与其杂交，只有目的蛋白部分能杂交上带，照相后可以看出是否有目的蛋白以及它的含量。致谢：感谢学院提供的实验平台，特别感谢张老师一周以来的实验讲授和指导，从目的基因的获得到载体酶切验证再到蛋白表达，一个基本完整的实验流程走下来收获很多，而且此次制蛋白胶也没有出现生化实验中多次反复胶未混匀不凝的情况，说明多联系还是有用的；此外，对于一些实验突发状况，如载体出现问题，老师为保证实验进度做处理方法：一边保存菌液培养，一边进行酶切和 PCR 验证，而后综合两者，获得正确重组质粒。既保证了质量，又节省了时间，通过这点也学到了一些处理方法。总之，通过本次大实验，在生化实验的116KD66KD45KD35KD25KD18KD14KD基础上又新学到了很多技能，而且对于以后的实验也是非常有帮助的，再次感谢老师！
