1、生物技术大实验实 验 报 告 集班级 生物技术 1212 学号 1220212206 姓名 宋扬 使用时间 2015.12.14 至 2015.12.19 组别 一 苏 州 科 技 学 院 化 学 与 生 物 工 程 学 院苏州科技学院化生学院学生实验报告 生物技术大实验 发酵工程工艺控制实验室学生守则一、严格遵守实验室各项规章制度和管理措施，服从教师及实验技术人员的指导。二、严格按照实验要求，做好实验预习,实验之前 5 分钟进入实验室，及时、准确地完成实验任务，实事求是地完成实验报告，杜绝弄虚作假。三、严格执行操作规定，爱护仪器设备及工具。凡不按教师的指导擅自操作引起仪器、设备损坏者，应予赔
2、偿。四、爱护实验室公共财物，节约水电、材料和试剂。未经允许不得随便挪动非实验需用的其他仪器，不得随便拆装仪器或将仪器、工具带至室外。五、持实验室的严肃安静，不得大声喧哗、嘻闹，严禁在实验室内抽烟和吃东西。六、严防事故，确保实验室安全，发现异常情况，应及时向有关教师和管理人员报告。七、每次实验结束后，主动整理好仪器设备，归还所借器材，关闭电源、水源，按指导老师的要求做好实验结束工作及室内外的清洁卫生工作，经指导老师许可后，方可离开。苏州科技学院化学与生物工程学院苏州科技学院化生学院学生实验报告 生物技术大实验 发酵工程工艺控制实 验 报 告实验名称 辅酶 Q10 发酵过程工艺控制组别 九实验结果
3、及实验分析与讨论：摘要：通过辅酶 Q10 产生菌类球红细菌 Rhodobacter sphaeroides 的培养，学会菌种在小型发酵罐中培养的过程，包括培养基和设备的灭菌、种子的培养、接种、发酵工艺控制等，进一步巩固所学的有关发酵过程的控制、中间补料、溶氧控制、变温发酵及代谢调节等工艺，学会分析代谢曲线，掌握有关参数及辅酶 Q10 的定量分析方法。关键词：辅酶 Q10，补料发酵，葡萄糖量，溶氧测定辅酶 Q10（Coenzyme Q10） ，是一种位于线粒体上的脂溶性化合物，化学名称为 2,3-二甲氧基-5-甲基-6-癸异戊烯基苯醌。辅酶 Q10 的制备方法有组织提取法、微生物发酵法和化学合成
4、法。目前，我国国内多家公司均实现了辅酶 Q10 的工业化生产，多采用微生物发酵法，且据报道，最高产量已达到 3000mg/L。葡萄糖是碳源中最易利用的糖,几乎所有的微生物都能利用葡萄糖,所以葡萄糖常作为培养基的一种主要成分,并且作为加速微生物生长的一种有效的糖。适量地增加葡萄浓度可以有效提高产物的合成量。因此，选择合适的葡萄糖补加方式并合理控制培养基中葡萄糖的浓度有利于产物的合成。本试验采用类球红细菌 Rhodobacter sphaeroides 进行深层液体发酵生产辅酶 Q10，发酵方式为流加分批发酵。通过流加补料将发酵过程中葡萄糖浓度分别控制在 10g/L-15g/L,5g/L-10g/
5、L,探究发酵过程中维持葡萄糖不同浓度对类球红细菌发酵生产辅酶 Q10 的影响。一、实验的仪器和试剂1、仪器BIOTECH-7BG 型发酵罐、高效液相色谱、显微镜、台式离心机、旋转蒸发仪等。2、菌种类球红细菌 Rhodobacter sphaeroides3、培养基（1）种子培养基（g/L）：葡萄糖 3，酵母提取物 8，NaCl 2，KH2PO4 1.3，MgSO47H2O 0.25, 1mL 辅液（2）发酵培养基(g/L) : 葡萄糖 30,甘露醇 7.5,玉米浆干粉 3，鱼粉蛋白胨 3，谷氨酸钠 5, NaCl 3.5 硫酸铵 3，KH2PO4 3，MgSO4 7H2O 15 ,FeSO4
6、1.25,MnSO4 0.12,1mL 辅液；用NaOH 调 pH 至 7.0（发酵罐培养基加 3ml 泡敌）辅液（g/L）：盐酸硫胺 1，生物素 0.015，烟酸 1，CuSO4 0.1。（3）补料培养基(g/L)：葡萄糖 300（4）发酵消泡剂配比（v）：泡敌水=110。（5）培养基灭菌方法：培养基等配好后在蒸汽灭菌罐内于 115下灭菌 30 分钟。二、实验的步骤1、发酵工艺条件路线为平板活化 菌种子斜面 摇瓶种子 罐发酵。2、斜面种子培养从平板培养基上单菌落接种于斜面培养基上，32恒温培养 3d。3、摇瓶种子培养250ml 摇瓶加入 50 ml 种子培养基，灭菌后冷却，挖一约 0.5cm
7、2 小块斜面放入培养基中，30，200r/min，培养 24h。4、发酵苏州科技学院化生学院学生实验报告 生物技术大实验 发酵工程工艺控制（1）罐发酵培养以 8%（v/v）接种量接种于 5L（装液 3L）发酵培养基中，32，pH6.80.2，0.03Mpa，3L/min（初始）,200 r/min（初始） ，补料分批培养，用氨水自动调节pH，到 120 小时（45d）左右放罐。接种后培养 2-3h 后，通过调节空气流量和转速，控制溶氧（DO）在 50%的水平。发酵液 pH 会先上升再下降，待其降至 6.8，通过补加氨水，控制 pH 在 6.8。每 4h 测一次葡萄糖含量，计算补料体积，分别维持
8、葡萄糖浓度（A）1211 班：葡萄糖浓度维持在 10-15 g/L。（B）1212 班：葡萄糖浓度维持在 5-10 g/L。补料速率：根据还原糖分析结果及溶氧水平情况进行补料（30-60min 补料一次） 。每班取 3 个摇瓶测定有关参数。（2）参数测定及记录在线参数每 1hr 记录一次；离线参数每 8hr 取样分析一次，包括总糖、还原糖、氨基氮、菌体浓度、pH、辅酶 Q10 含量等。（3）放罐条件待发酵后期，辅酶 Q10 产量下降，溶氧上升，pH 上升，开始下罐。5、离线参数测定在发酵过程中每 4 小时取一次样分析以下项目：(1) 美蓝染色，镜检观察，并记录类球红细菌细胞菌体形态。(2) 菌
9、体浓度测定：干重法。 （见附录 1）(3) 还原糖测定：生物传感分析仪。 （见附录 2）(4) 取发酵液离心后的上清液用甲醛滴定法测氨基氮。 （见附录 3）(5) 辅酶 Q10 的提取及定量测定：用酸热法提取 Q10（在 90水浴锅加热，注意不要用电炉加热），用 HPLC 测定辅酶 Q10 的含量。 （见附录 4）6、在线参数测定在发酵罐上连续测定 pH、溶氧(DO)、转速、流量、温度等。7、记录所测参数，记入辅酶 Q10 发酵批报表。三、辅酶 Q10 发酵过程有关离线参数的分析方法1、 菌体浓度的测定(1)菌体浓度的测定用离心法取 5mL 菌液于已称好管重（W0）的 10mL 离心管中（每次
10、 3 个平行） ，4下离心 15min，离心转速为 5000 rpm。离心所得菌体用稀盐酸溶液(0.05M HCl:约 4mL HCl 加水至 1L)洗涤两次，称湿重 W1， 。注意：洗涤时，要充分震匀。打开离心管盖，至 80烘箱中烘至恒重，称干菌体与离心管重量 W2。(2)计算公式湿重 X1=(W1W0)20干重 X2=(W2W0)20W1：湿菌体与离心管重量，g；W2：干菌体与离心管重量，g；W0：离心管重量，g；单位：g/L。2、发酵液中还原糖测定生物传感分析仪测定发酵液中还原糖测定操作在“准备就绪”状态下，按“运行”键，仪器自动清洗 2 次，以更新反应池和管道内的缓冲液，清洗结束后进入
11、自动定标状态。这时，注入 25l 标样，仪器自动开始测定标样并定标，测定完苏州科技学院化生学院学生实验报告 生物技术大实验 发酵工程工艺控制成后，自动清洗一次，进入下一测定循环。仪器根据上次定标时的测定误差，自动判断是否需要继续定标，如需要，则再次提示定标。当完成仪器标定后，绿灯不再闪烁，仪器进入测定样品状态。注入 25l 样品，根据结果确定要稀释的倍数。初始为 40 倍。3、发酵液中氨基氮的测定（一）实验材料(1)中性甲醛溶液将试剂级甲醛（36-37%）调到 PH7（用 PH 计检查） 。或是在 50ml36-37%甲醛中加入几滴 0.5酚酞乙醇水溶液，然后用 0.2N 氢氧化钠溶液滴定到微
12、红。 （需临用前配制，若放置一些时间后，在使用前要重新中和。 ）(2)酚酞指示剂0.5%酚酞的 50%乙醇溶液。(3)标准碱溶液0.1N 氢氧化钠溶液，使用前应标定。(4)溴酚兰指示剂0.05%溴酚兰的 20%乙醇溶液。（二）实验方法(1)分别吸取发酵液离心上清液 2.0ml 于两个磨口具塞锥形瓶中，各加蒸馏水 5ml。向另一磨口具塞锥形瓶中加入 7ml 蒸馏水，做空白对照。(2)向上述三个瓶中各加中性甲醛溶液 5.0ml，混匀，加溴酚兰指示剂 2 滴，加酚酞指示剂 4 滴。(3)用标准 0.100mol/LNaOH 溶液滴定至红色，分别纪录消耗的 NaOH 毫升数。4、菌体中辅酶 Q10 含
13、量提取与测定(1)菌体细胞的破碎酸热法：酸热法处理菌体主要是利用盐酸对细胞中的糖及蛋白质等成分的作用,疏松细胞的结构，再经过沸水、冷冻处理，使细胞达到破碎的效果，辅酶 Q10 得率相对较高，操作也相对简单。酸热法：取 1ml 发酵液，加入 0.2mL 0.1 mol/L 的盐酸，于 90C 水浴锅中，水浴处理 15 min。破壁好迅速冷却，5000rpm 离心 10min，弃尽上清。加入 5mL 提取液（乙酸乙酯：乙醇=5:3，体积比） ，漩涡震荡仪上混匀，置于超声波清洗仪中超声抽提 15min,暗室中抽提 15min,每隔 5min 摇匀一次。将抽提液离心 10min。上层有机相 0.46m
14、 滤头过滤，待测。(2)辅酶 Q10 含量的分析辅酶 Q10 用 HPLC 进行分析，液相分析仪器为安捷伦，色谱柱为 C18 反相柱（5m4.6mm150mm） 。流动相为甲醇：异丙醇=3：1，柱温箱为 40，流速为 1mL/min，检测波长是 275nm。辅酶 Q10 标准品梯度稀释后经 HPLC 分析建立。辅酶 Q10 标准曲线：y=0.06729x R2=0.99996 (x 为峰面积，y 为辅酶 Q10 浓度 mg/L)菌体中辅酶 Q10 含量 y=0.06729*5x=0.33645x (提取时，辅酶 Q10 稀释了 5 倍)苏州科技学院化生学院学生实验报告 生物技术大实验 发酵工程
15、工艺控制苏州科技学院化生学院学生实验报告 生物技术大实验 发酵工程工艺控制四、实验结果菌体量随着时间增加而增长，而辅酶 Q10 含量也随着菌体量的增长而变大。后期因为菌体量的减少，Q10 产量也开始降低。下罐。还原糖浓度（柱状图）还原糖浓度不断下降，在 24 小时开始每隔一段时间补充葡萄糖，使葡萄糖含量维持在 6 左右。一开始溶氧在 100%，随着菌体生长发酵，开始下降，控制在 30%左右，随着菌体增加，降为 0，后期发酵罐变粘，影响氧气传递。前期消耗氮源，产氨，pH 上升，随着菌体生长繁殖，消耗碳源，产酸，pH 下降，糖缺乏时，pH 上升，补充碳源，使 pH 维持在 6.8 左右。当 pH
16、过低时，通过补加氨水，使 pH 维持稳定。实验成绩： 教师： 日期： 苏州科技学院化生学院学生实验报告 生物技术大实验 发酵工程工艺控制实 验 报 告五、参考文献【1】李啸生物工程专业综合大实验指导北京：化学工业出版社，2009【2】陈长华发酵工程实验北京：高等教育出版社，2009【3】黄儒强，李玲生物发酵技术与设备操作北京：化学工业出版社，2006苏州科技学院化生学院学生实验报告 生物技术大实验 发酵工程工艺控制学 期 实 验 小 结转眼间，我已从懵懂的大一新生变成了大四老生，我开始渐渐觉得焦虑，以及对未来的恐惧。不知道自己的未来会怎么样，虽然确定了一定要考研，可是也不知能不能考上理想的学院
17、。否则，就要踏上未知的社会，开始另一段人生必要的过程。 在本学期刚过一半时段的时候我们开始了“传说”中的大实验，毕竟我们大一到大三的实验都是比较容易的，花时间较少的，没有这么长时间的，而且要花很多精力。更重要的是还有来自考研的压力。虽然一度想过要放弃做这个实验，不过我还是认真的做了，虽然做的并不理想。其实，对这个实验我还是很上心，虽然不怎么想做，想要集中精力好好考研。 这次的实验是连续发酵测定辅酶 Q10，这个实验出了要求对实验的原理及方法步骤了解透彻外，还要有很强的实践动手操作能力。还有，作为组长，与人沟通的能力，还有独立思考的能力也是必须要具备的 。清楚的弄明白实验的每一步应该做什么，并努力把每一步做好，同时学会与小组的其他成员通力合作，才能让实验去的成功。 本次实验不仅让我学到了丰富的实验知识，对这门学科（课程）的知识，丰富了实践经验，这次实验将会有利于我更好的适应将来的生活以及以后的工作，我会好好把握每一次的实验机会，争取汲取到更多的经验和知识，这样以后才不至于什么都不能独自完成和独立思索。
