1、流式细胞仪背景知识,总览,流式细胞术基本知识流式细胞仪的组成数据采集与分析,流式细胞技术是什么？,流式细胞术 在流动的状态中检测细胞或颗粒的各项特性 特异性强，灵敏度高，速度快，并能实现多参数分析 可检测的样本种类多样：外周血，骨髓，细胞穿刺液，洗脱液，实体组织，培养细胞，微生物,Flow Cytometry Flow:Fluid Cyto:Cell Metry:Measurement,流式细胞术检测样本,0.4um,40um,流式细胞术检测指标,流式细胞术提供的信息：- 相对细胞大小- 相对细胞颗粒密度和内部复杂度- 染色过细胞的相对荧光强度,细胞结构 细胞大小 细胞粒度 DNA含量与细胞周
2、期 RNA含量 蛋白质含量 染色体分析,细胞功能 细胞表面/胞浆/核的特异性抗原 细胞活性 细胞内细胞因子 酶活性 激素结合位点 细胞受体 细胞凋亡,在上述信号基础上的细胞分选,流式细胞术的应用,流式细胞仪组成,液流系统：形成层流系统，聚焦细胞 光学系统：产生和收集光学信号 电子系统：光信号转化为电信号，进行信号处理,Fluidics Diagram,Sheath Flow,sheath tank,Sample Flow,sheath interior reservoir,waste interior reservoir,sheath filter,sample injection,tube
3、(SIT),test tube or plate,flow cell,interrogation point,bubble filter,waste tank,液流系统,光学系统,激发光学系统包括: - 激光器 - 透镜和反射镜，将激光引导到检测区域 收集光学系统包括: 滤光片，将产生的光信号引导到对应的光学接收器,光学系统,光学系统-滤光片,460 500 540,460 500 540,460 500 540,SP 500,LP 500,BP500/50,Longpass Shortpass Bandpass,电子系统,电子系统,电子系统,Review,悬浮状态的细胞 单个流过流动室细胞被
4、激发 产生散射光和荧光 信号信号被采集 转换成数字信号 存储于电脑上,液流系统,光学系统,电子系统,回顾,流式细胞仪的三大组成部分？滤光片LP600代表什么意思？BP400/40呢？,数据采集,三种数据：- 前向散射光FSC- 侧向散射光SSC- 各种荧光散射光FL1，FL2，FL3，FL4,当使用激光光源时，在前向方向（和激光行进的方向相同）上可用前向散射光接收通道接收到一定量的散射光 前向散射光的强度是和细胞或其他检测颗粒的大小、形状密切相关的,数据采集-前向散射光,当激光光源被使用时，侧向也有一定量的散射光产生，可以用90o 角的侧向散射光检测通道来采集 侧向散射光的强度和细胞或其他检测
5、颗粒的颗粒密度、内部复杂程度密切相关,数据采集-侧向散射光,外周全血细胞散射光双参数点图,颗粒杂质、气泡 对检测的影响,细胞标记上荧光物质后，这种荧光物质要求特定波长的激发光来激发，同时发出特定波长的光 荧光物质被激发以后产生的发射光将由特定的荧光通道来接收 特定检测是通过光学滤片和透镜来控制的,数据采集-荧光信号,荧光强度是和细胞上标记上的荧光染料的量正相关,数据采集,电压,信号放大方式：log、lin 信号类型：A,W,H 电压的调节:根据阴性对照管来调节,阈值,可以以任意参数及多个参数的组合作为阈值 大多数样本都可以设定FSC/SSC 阈值以下的信号不存储 根据阴性对照管来调节 目的是将
6、不需要的杂质信号，噪音信号，无用的细胞信号等扣除，使收集到的都是有用信号,补偿,补偿方式：任意两个通道之间，可以采用手动或自动补偿。 补偿的调节:根据单染对照管来调节,1.) Compensation - Too Little; Too Much,2.) Basic Principles of Compensation - % Compensation is independent of fluorescence intensity,3.) Compensation- Too Dim, Too Bright Compensation Controls,Small errors in compe
7、nsation of a dim control (A) can result in large compensation errors with bright reagents (B & C).,数据分析,流式数据 直方图 散点图 等高线图 密度图 三维图 统计数据,直方图,直方图(Distribution Histogram) 横坐标代表荧光信号或散射光信号相对强度，单位是对数，可以是线性或对数坐标。 纵坐标一般是细胞数。,散点图,散点图(Dot Plot) X坐标为该细胞一参数相对含量，Y坐标为该细胞另一参数的含量，可以将细胞亚群分开。,等高线图和密度图,三维图,统计数据,Events 百分比 平均荧光强度 荧光中位值 CV SD ,数据获取与分析,电压 阈值 补偿,获得数据,画图 设门 统计,Thanks!,
