1、土壤微生物的分离鉴定及数量测定方法 土 壤 微 生 物 的 分 离 鉴 定 及 数 量 测 定（一） 培养基的制备测定微生物总量培养基：1. 细菌培养基（牛肉膏蛋白胨琼 脂 培养基）牛肉膏 Beefextract 5.0g蛋白胨 Peptone 10.0gNaCI 5.0g蒸馏水 H20 1000m1琼脂 1520gPH 7.27.4制备步骤： 在 100 mL 小烧杯中称取牛肉膏 5.0g，蛋白胨 10.0g，加 50 mL 蒸馏水，置电炉搅拌加热至牛肉膏，蛋白胨完全溶解. 向小铝锅中加入 500 mL 蒸馏水，将溶解的牛肉膏，蛋白胨倒入铝锅中并用自来水洗 23 次 .加入5.0gNaC1，
2、在电炉上边加热边搅拌 . 加入洗净的琼脂条，继续搅拌，加热至琼脂完全熔化，补足水量至 1000 mL.用 NaOH 或 HC1 调至 pH7.0. 用酸度计或用玻棒沾少许液体用精密 pH 试纸测定其 pH 值，并用 10NaOH调至所需 pH 值，必要时用滤纸或脱脂棉过滤。一般比要求的 pH 高出 0.2，因为高压蒸汽灭菌后，pH 常降低。根据不同需要，可将配好的培养基分装入配有棉塞的试管或三角瓶内。注意分装时避免培养基挂在瓶口或管口上引起杂菌污染。如液体培养基，应装试管高度的 1/4 左右；固体培养基装试管高度的 1/5 左右；装入三角瓶的量以三角瓶容量的一半为限。 ，塞好棉塞，装入小铁丝筐
3、，然后用旧报纸将棉塞部分包好. 标签表明培养基的名称、配制日期等。 高压蒸汽灭菌，用 0.1Mpa（15lb/in2）121灭菌（15-20）30min.2. 放线菌培养基 （改良高氏 1 号琼脂培养基）可溶性淀粉 20gKNO3 1gK2HPO4 0.5gMgSO4 7H2O 0.5gNaCl 0.5g 原 0.05gFeSO4 7H2O 0.01gpH 7.2-7.4制备步骤：（1 ） 计算 根据配方计算各种药品所需要的量，然后再分别称量。（2 ） 称量 准确称量各种成分。（3 ） 溶化 配制时，先用少量冷水将淀粉调成糊状，倒入少许沸水中，在火上加热，边搅拌边依次逐一溶化其他成分，溶化后，
4、补足水分到 1000ml，调 PH（可不调） 。植保学院烟草实验室 张丽（4 ） 分装、包扎、灭菌。注：各成分按配方顺序依次溶解，对于微量成分，可预先配成高浓度的溶液，方便配置时量的控制。配制时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，倒入少于所需水量的沸水中，在火上加热，边搅拌边依次逐一溶化其他成分，溶化后，补足水分到 1000ml，调 pH。 另：倒平板之前，在溶化的培养基中加重铬酸钾溶液，每 300mL 培养基加 3%重铬酸钾 1mL(l00ppm)。3. 真菌培养基（马丁（Martin）- 孟加拉红琼脂培养基）葡萄糖 10.0gMgSO4.7H2O 0.5g 蛋白胨 5.0g 孟加拉红 33.4
5、mg （或者每升加 1%溶液 3.3mL）K2HPO4 1g蒸馏水 H20 1000m1PH 自然(4-5)制备步骤：（1 ）计算 根据配方计算各种药品所需要的量，然后再分别称量。（2 ）称量和熔化 按培养基配方，准确称取各成分，并将各成分依次溶化在少于所需要的水量中待各成分完全溶化后，边加边搅拌, 以防糊底,补足水分到所需体积。再将孟加拉红配成 1%的溶液，在 1000ml 培养液中加入 1%的孟加拉红溶液 3.3ml，混匀后，加入琼脂加热溶化。(3) 分装、加塞、包扎、灭菌。(4) 链霉素的加入 由于链霉素受热易分解，所以临用时将培养基溶化后待温度降低至 45 摄氏度左右时才能加入。注 ：
6、 灭 菌 前 加 卡 那 霉 素 20 g/ml， 或 者 倒 平 板 之 前 加 链 霉 素 。 倒 平 板 之 前 加 乳 酸 ， 每 100mL 培 养 基 加 0.lmL。测定功能菌所用培养基：1.亚硝酸细菌培养基（改良的斯蒂芬逊（Stephenson ）培养基 A）(NH4)2SO4 2.0g NaH2PO4 0.25gMnSO44H2O 0.01gMgSO47H2O 0.03gK2HPO4 0.75gCaCO3 5.0g蒸馏水 1000mlPH 7.2注：CaCO 3 最后加，不需要溶解，直接调 PH，培养基中有这个成分是为了缓冲 pH。因为硝化细菌的生长会产生酸化效应，使得氢离子
7、过剩，到了一定程度硝化作用将无法继续，所以要碱性物质平衡酸碱。下同。2.硝酸细菌培养基（改良的斯蒂芬逊（Stephenson ）培养基 B）NaH2PO4 0.25gK2HPO4 0.75gMgSO47H2O 0.03g土壤微生物的分离鉴定及数量测定方法 MnSO44H2O 0.01gCaCO3 1.0g Na2CO3 1.0gNaNO2 1.0g蒸馏水 1000mlPH 7.23. 反硝化细菌培养基柠檬酸钠 5.0 gKNO3 2.0 gKH2PO4 1.0 g,K2HPO4 1.0 gMgSO47H2O 0.2 g蒸馏水 1000 mlpH 值 7.27.54.好气性自生固氮菌培养基（改良
8、阿须贝(Ashby)无氮培养基）苯甲酸钠 1.5 gK2HPO4 0.2 gMgSO47H2O 0.2 gNaCl 0.2 g CaSO42H2O 0.1 g PH 7.47.6注：在培养基分装入试管时，每管加入一 1cm 滤纸长条，要露出液面。5.氨氧化细菌培养基（蛋白胨氨化培养基）K2HPO4 0.5 gKH2PO4 0.5 g,MgSO47H2O 0.5 g蛋白胨 5.0 g蒸馏水 1000mlPH 7.07.26. 好气性纤维素分解菌培养基（依姆歇涅茨基纤维素分解菌培养基）KH2PO4 1.0 gFeCl36 H2O 0.1 gMgSO47H2O 0.3 gCaCl26H2O 0.1
9、g NaCl 0. 1 g NaNO3 2.5 gpH 7.274植保学院烟草实验室 张丽注：在培养基分装入试管时，每管加入一 1cm 滤纸长条，需露出液面。(二)试剂的配制1.格里斯试剂（Griess Reagent ）第一、第二液：第一液：将 0.5g 的对氨基苯磺酸（Sulfanilic Acid）溶于 150ml 的 20-30%稀醋酸溶液中，保存于棕色瓶中。第二液：将 0.5g-萘胺（-naphthylamine）加入 50ml 蒸馏水中，煮沸后，缓缓加入 150ml 的20-30%稀醋酸溶液中，保存于棕色瓶中。2. 纳氏试剂甲液：将 20.0g 碘化汞和 10.0g 碘化钾溶于 1
10、00ml 蒸馏水中。乙液：将 20.0g 氢氧化钾溶于 100ml 水中。分别配制甲、乙二液，待冷却后混合，放置 2 天后使用。保存于棕色瓶中。取上清液使用，保存期三周，随着沉淀增加会影响测定结果。3.二苯胺试剂：溶 1.0g 无色的二苯胺（Diphenylamine ）于 20ml 蒸馏水中，然后徐徐加入 100ml 浓硫酸（相对密度 1.84）中，保存于棕色瓶中。（三）实验器材1.仪器设备4冰箱、立式自动电热压力蒸汽灭菌器、恒温培养箱、电子天平、电热恒温水浴锅、超净工作台、微量移液器、全温空气摇床、旋涡混合器、磁力搅拌器、微波炉等。2.器材准备将 90ml 水装入 250ml 三角瓶中，并
11、装有 15-20 个玻璃珠，灭菌。将 9ml 水装入试管，灭菌。试管架，1ml 无菌吸管，记号笔，白瓷比色板，接种环，酒精灯等。（四）实验方法1.样品采集在靠近植株根系部, 去除表层 0-5cm 的表土，采集 5-20 cm 土壤剖面,多点采集, 混匀后四分法取 1 kg, 装无菌塑料袋带回，4冰箱保存。2.悬液制备称取 10g 土壤样品，放入盛有 90ml 无菌水的三角瓶中，置于摇床上室温振荡 20min，使土样与水充分混合，将土壤中的微生物细胞充分分散，从土壤中分离出来。此为 10-1土壤悬液，吸取 lml 此土壤悬液于 9ml 无菌水中，另用无菌吸管吹吸 3 次混匀，制成 10-2土壤悬
12、液。以此类推依次制成 10-3、10 -4、10 -5、10 -6、10 -7、10 -8不同稀释度的土壤悬液。土壤微生物的分离鉴定及数量测定方法 3.土壤悬液稀释度选择细菌:10 -410-6放线菌：10 -310-5真菌：10 -210-4以上采用稀释平板法，分别设置三个浓度梯度，二次重复。亚硝酸细菌：10 -310-6 硝酸细菌：10 -310-6反硝化细菌：10 -410-7好气性自生固氮菌：10 -310-6氨氧化细菌：10 -510-8好气性纤维素分解菌：10 -210-5以上采用最大或然法（MPN） ，分别设置四个浓度梯度，三次重复。4.接种(平板接种技术)平板接种是用接种环将菌
13、种接至平板培养基上,或用移液管,滴管将一定体积的菌液移至平板培养基上,然后进行培养.其目的是进行菌落形态观察,分离纯化菌种,活菌计数,或进行其它试验.其方法有多种,根据实验的目的要求不同,可分以下几种.斜面菌种接至平板划线法:按无菌操作的方法自斜面用接种环直接取少量菌体 ,在平板培养基表面自左至右轻轻连续划线或分区划线,注意不要划破培养基.或先制成菌悬液,接种在平板边缘的一处,将接种环灼烧灭菌,再从有菌的部位如上方法划线接种.点接法:一般用于霉菌菌落观察的接种.无菌操作下 ,用接种针从斜面或孢子悬液中取少量孢子,轻轻点接在平板培养基上,点接的部位和点接的次数根据实验目的与要求确定.菌悬液接至平
14、板涂抹法:用灭菌的移液管或滴管吸取一定体积的菌液移至平板上 ,然后用无菌的玻璃涂棒将菌液均 匀涂布在整个平板上.混菌法:先将菌液加入培养皿中,然后加入融化并冷却至 4550的固体培养基,轻轻摇匀,平置,待完全凝固后倒置培养.平板菌种接至斜面此法一般是将分离培养得到的单菌落,在无菌操作下分别接种到斜面培养基上,以便进一步扩大培养或作保存之用.接种之前先选好平板上的单菌落,并做好标记.左手拿平板,右手拿接种环,在火焰上方或火焰旁边操作,灼烧接种环后将接种环在空白培养基处冷却,以免将菌种烫死,然后挑取菌落,在火焰旁边稍等片刻,此时左手将平板放下,拿起斜面培养基,按斜面接种的方法接种.5.培养将所有试
15、管和平板置于 25-28黑暗条件下避光培养。培养时间由短到长分别为：真菌：23d；植保学院烟草实验室 张丽细菌：34d；放线菌：57d。氨氧化细菌：78d；好气性自生固氮菌：78d；亚硝酸细菌：1014d； 硝酸细菌：1014d；反硝化细菌：1014d；好气性纤维素分解菌：1014d；6.结果观察亚硝酸细菌：取出培养液 5 滴于白瓷比色板上，加入格里斯试剂（Griess Reagent）第一、第二液各两滴，如有亚硝酸盐存在，则呈红色。硝酸细菌：取出培养液 5 滴于白瓷比色板上，加入格里斯试剂（Griess Reagent）第一、第二液各两滴，如不呈红色，表示亚硝酸均已经完全消失。此时，另取培养
16、液 5 滴于白瓷比色板上，加二苯胺试剂 2 滴，如呈蓝色，则表示亚硝酸已经被氧化成硝酸，说明有硝酸细菌的存在。反硝化细菌：加入格利斯亚硝酸试剂，观察颜色变化，确定正负反应。好气性自生固氮菌：观察试管培养液表面与滤纸接触处有无褐色或黏液状菌膜生成，或有无圆晕混浊出现。氨氧化细菌：取出培养液 5 滴于白瓷比色板上，加入纳氏试剂两滴，如有氨氧化细菌存在，则呈棕色或褐色。好气性纤维素分解菌：观察滤纸条是否成团，有无黄色或橘黄色菌斑出现及滤纸断裂情况。7. 镜检计数稀释平板菌落计数平板接种培养有混合平板培养法和涂抹平板培养法两种方法.混合平板培养法将无菌平板编上 10-7,10-8,10-9 号码,每一
17、号码设置三个重复 ,用无菌吸管按无菌操作要求吸取 110-9 稀释液各 1mL 放入编号 10-9 的 3 个平板中 ,同法吸取 10-8 稀释液各 1mL 放入编号 110-8 的 3 个平板中,再吸取110-7 稀释液各 1mL 放入编号 110-7 的 3 个平板中,由低浓度向高浓度时,吸管可不必更换.然后在 9 个平板中分别倒入已熔化并冷却至 45 50的细菌培养基(图 5-2),轻轻转动平板,使菌液与培养基混合均匀,冷凝后倒置,在 30下培养.至菌落长出后即可计数 .涂抹平板计数法涂抹平板计数法与混合法基本相同,所不同的是先将培养基熔化后趁热倒入无菌平板中,待凝固后编号,然后用无菌吸
18、管吸取 0.1mL 菌液对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上,每个编号设三个重复.再用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀(图 24-3),每个稀释度用一个灭菌刮铲 ,更换稀释度时需将刮铲灼烧灭菌.在由低浓度向高浓度涂抹时,也可以不更换刮铲.将涂抹好的平板平放于桌上 2030min,使菌液渗透入培养基内,然后将平板倒转,保温培养,至菌落长土壤微生物的分离鉴定及数量测定方法 出后即可计数.计算结果时,常按下列标准从接种后的 3 个稀释度中选择一个合适的稀释度,求出每克菌剂中的含菌数.(1)同一稀释度各个重复的菌数相差不太悬殊.(2)细菌,放线菌,酵母菌以每皿 30300 个菌落为宜,霉菌以每皿 101
19、00 个菌落为宜.选择好计数的稀释度后,即可统计在平板上长出的菌落数,统计结果按下式计算.混合平板计数法:每 g 样品的菌数= 同一稀释度几次重复的菌落平均数稀释倍数涂抹平板计数法:每 g 样品的菌数= 同一稀释度几次重复的菌落平均数10稀释倍数尽管使用不同的培养基，但细菌、放线菌和真菌都可能在同一个培养基上生长，所以必须用显微镜做进一步的观察。明显有菌丝的一般是真菌，真菌的菌丝为丝状分枝，比较粗大；而放线菌菌丝呈放射状，比较细。细菌有球状和杆状，有些细菌也形成细小的菌丝。酵母菌的菌落与细菌的菌落很相似，但在显微镜下容易分辨。酵母菌个体比较大，一般有圆形、椭圆形、卵形、柠檬形或黄瓜形，有些还有
20、瘤状的芽。在两级稀释度中，选细菌和放线菌的菌落数为 30200 个、真菌菌落数为 2040 个的培养皿各 5 个，取其平均值计算出每组的菌落数。如果菌落很多，可将其分成 24 等份进行计数。微生物生物量可以通过微生物细胞个体大小和密度计算得到。8.计算土壤微生物数量（cfug-1）=MD/W式中 M 为菌落平均数：D 为稀释倍数；W 为土壤烘干质量（g） 。植保学院烟草实验室 张丽背景知识：微 生 物微生物( microorganism 简称 microbe 是包括细菌、病毒、 真菌 以及一些小型的 原生动物 、显微藻类等在内的一大类生物群体，它个体微小，却与人类生活关系密切。涵盖了有益有害的
21、众多种类，广泛涉及健康、食品、医药、工农业、环保等诸多领域。 微生物的定义现代定义：微生物是一切肉眼看不见货看不清的微小生物的总称。形体微小，结构简单，通常要用 光学显微镜 和电子显微镜才能看清楚的生物，统称为微生物。 （但有些微生物是可以看见的，像属于真菌的蘑菇、 灵芝 等。）1 特点： 个体微小, 一般 0.1mm。构造简单, 有单细胞的, 简单多细胞的, 非细胞的。进化地位低。2 分类： 原核类: 三菌, 三体。三菌：细菌、蓝细菌、放线菌 三体：支原体、衣原体、立克次氏体。真核类: 真菌, 原生动物, 显微藻类。非细胞类: 病毒, 亚病毒 ( 类病毒, 拟病毒, 朊病毒) 。3 五大共性
22、：体积小, 面积大； 吸收多, 转化快 ；生长旺,繁殖快；适应强,易变异； 分布广, 种类多微 生 物 的 类 群种 类原核：细菌、放线菌、螺旋体、支原体、立克次氏体、衣原体。真核：真菌、藻类、原生动物。 非细胞类：病毒和亚病毒。一般地，在中国大陆地区的教科书中，均将微生物划分为以下 8大类：细菌、病毒、真菌、 放线菌 、 立克次体 、 支原体 、 衣原体 、 螺旋体 。1 细菌: (1)定义: 一类细胞细短, 结构简单, 胞壁坚韧, 多以二分裂方式繁殖和水生性强的原核生物(2)分布: 温暖, 潮湿和富含 有机质 的地方(3)结构: 主要是单细胞的原核生物, 有球形, 杆形, 螺旋形基本结构：
23、细胞膜 细胞壁 细胞质 核质。特殊结构：荚膜、鞭毛、菌毛、芽胞( 4)繁殖: 主要以二分裂方式进行繁殖的( 5)菌落: 单个细菌用肉眼是看不见的, 当单个或少数细菌在 固体培养基 啊行大量繁殖时, 便会形成一个肉眼可见的, 具有一定形态结构的子细胞 群落 .菌落是菌种鉴定的重要依据. 不同种类的 细菌菌落 的大小, 形状光泽度颜色硬度透明度都不同. 2 放线菌(1)定义: 一类主要成菌丝状生长和以 孢子 繁殖的陆生性较强的原核生物(2)分布: 含水量较低, 有机物较丰富的, 呈微碱性的 土壤 中 土壤微生物的分离鉴定及数量测定方法 (3)形态构造:主要由菌丝组成,包括基内菌丝和气生菌丝(部分气
24、生菌丝可以成熟分化为孢子丝,产生孢子) (4)繁殖:通过形成无性孢子的形式进行无性繁殖(5)菌落:在固体培养基上:干燥, 不透明,表面呈致密的丝绒状 ,彩色干粉真 菌真菌（F ungus）是一种真核生物。最常见的真菌是各类 蕈类 ，另外真菌也包括霉菌和酵母。现在已经发现了七万多种真菌，估计只是所有存在的一小半。大多真菌原先被分入动物或植物，现在成为自己的界，分为四门真菌通常又分为三类，即酵母菌、霉菌和 蕈菌 （大型真菌），它们归属于不同的亚门。真菌的细胞既不含 叶绿体 ，也没有 质体 ，是典型异养生物。它们从动物、植物的活体、死体和它们的排泄物，以及断枝、落叶和土壤 腐殖质 中、来吸收和分解其
25、中的有机物，作为自己的营养。真菌的异养方式有 寄生 和 腐生 。真菌常为丝状和多细胞的有机体，其营养体除大型菌外，分化很小。高等大型菌有定型的 子实体 。除少数例外，真菌都有明显的细胞壁，通常不能运动，以 孢子 的方式进行繁殖。真菌菌落：大小：大。形状：绒毛状，絮状，蛛网状。颜色：五颜六色（孢子的颜色）真菌：念球菌、粘菌等。 细 菌 的 菌 落 特 征 与 繁 殖细菌在固体培养基上分裂繁殖时，许多细胞堆集在一起，形成肉眼可见的群体称为菌落。不同种类的细菌其菌落形态互不相同，表现在大小、形状、边缘、隆起、光泽、质地和颜色等方面。细菌菌落大小不一，小的不到 1 毫米，大的可以铺满整个培养皿；菌落形
26、状有圆形、不规则形、卷发状、假根状等；菌落的隆起形状有扩展、台状、低凸、乳头状等；有的菌落有光泽、有的没有；有的菌落较粘，有的则较脆；菌落一般呈灰色，少数为白色、黄色、红色、绿色和棕色等。大小：小。形状：光滑，粘稠或粗糙干燥。颜色：多为白色。细菌一般进行无性繁殖，表现为细胞的横分裂，称为裂殖。裂殖结果形成两个大小相同的子细胞。在最适宜的条件下，2030 分钟就能分裂 1 次，并可继续分裂若干次。当继续分裂时，常因养料供应不足或温度变化以及其它种种原因而停止分裂或死亡。放 线 菌 的 菌 落 特 征 与 繁 殖放线菌的菌落质地致密，表面呈紧密的绒状，或坚实、干燥而多皱。由于基内菌丝长在培养基内，
27、所以菌落与培养基结合较紧，不容易被挑起，或者被挑起后不容易破碎。当孢子丝形成大量孢子布满菌落表面时，使菌落呈絮状、粉末状或颗粒状，而与细菌菌落判然有别。此外，如用放大镜仔细观察，可以看见菌落周围有放射状菌丝。放线菌主要通过形成无性孢子的方式进行繁殖。其孢子丝成熟时，分化形成许多孢子，称为分生孢子。分生孢子常具色素，呈白、灰、黄、橙黄、红、蓝、绿等颜色。孢子丝形成孢子的方式有凝聚分裂和横隔分裂两种。大多数放线菌按凝聚分裂方式形成孢子，其过程是在孢子丝内从顶端到基部，细胞质分段围绕核质，逐渐凝聚成一串大小相似的小段，然后每一小段外面产生植保学院烟草实验室 张丽新的孢子壁而形成孢子，最后孢子丝壁破裂
28、，将孢子释放出来。少数放线菌按横隔分裂方式形成孢子，其过程是在孢子丝内产生许多距离均等的横隔，然后在横隔处断裂形成孢子。另外有些放线菌可在菌丝上形成孢子囊，在孢子囊内形成孢囊孢子，但这样的种类很少。土壤稀释液的配制：悬液制备准确称取待测土样品 10g,放入装有 90mL 无菌水并放有小玻璃珠的 250mL 三角瓶中,用手或置摇床上振荡 20min,使微生物细胞分散,静置 2030s, 即成 10-1 稀释液;再用 1mL 无菌吸管,吸取 10-1 稀释液 1mL,移入装有 9mL 无菌水的试管中,吹吸 3 次,让菌液混合均匀,即成 10-2 稀释液;再换一支无菌吸管,吸取 10-2 稀释液 1mL,移入装有 9mL 无菌水的试管中,也吹吸 3 次,即成10-3 稀释液 ;以此类推,连续稀释,制成 10-4,10-5,10-6,10-7,10-8,10-9，10-10 等一系列稀释菌液注意事项：1、培养基提前一天倒入培养皿，室温存放一天，另培养基表明干燥。2、做无菌水接种对照，检测污染情况。3、吸取 10-6，10-8 和 10-10 稀释液 100ul，均匀涂布。
