1、 山东大学实验报告 2014 年 11 月 30 日姓名 班级 13 级生命基地班 学号 同组者： 科目 微生物学实验 题目 微生物大小及数量的测定 组别 3第 1 页 共 9 页 微生物实验报告【实验题目】 微生物大小及数量的测定【实验目的】1. 了解显微镜测定微生物大小与血球计数板测定微生物数量的原理。2. 学习并掌握显微镜下测定微生物细胞大小的技术，包括目镜测微尺、镜台测微尺的校正技术与测定细胞大小的技术。3. 了解血球计数板的结构，学习并掌握血球计数板计数微生物数量的技术，包括样品的点样、菌数计数的方法与计算。【实验器材】1、菌种：酵母菌液，枯草芽孢杆菌2、试剂： 结晶紫，蒸馏水，香柏
2、油，二甲苯等3、仪器和用具： 显微镜，目镜测微尺，镜台测微尺，血球计数板、盖玻片、吸水纸、计数器、滴管、擦镜 纸，酒精灯等【实验原理】一、微生物大小的测定1、 测微尺的构造 微生物细胞的大小，是微生物重要的形态特征之一，也是分类鉴定的依据之一。由于菌体很小、只能在显微镜下来测量。显微镜测微尺是由目镜测微尺和镜台接物测微尺组成。目镜测微尺山东大学实验报告 2014 年 11 月 30 日姓名 班级 13 级生命基地班 学号 同组者： 科目 微生物学实验 题目 微生物大小及数量的测定 组别 3第 2 页 共 9 页 微生物实验报告目镜测微尺是一块圆形玻璃片，其中有精确的等分刻度，在 5mm 刻尺上
3、分 50 份，或把 10 mm 长度刻成 100 等分。测量时，将其放在接目镜中的隔板上(此处正好与物镜放大的中间像重叠)来测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同，目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用置于镜台上的镜台测微尺校正，以求出在一定放大倍数下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。镜台测微尺镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般将 lmm 等分为 100 格，每格长l0m（即 0.0lmm），是专门用来校正目镜测微尺的。校正时，将镜台测微尺放在载物台上，由于镜台测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经过物镜和目镜的
4、两次放大成象进入视野，即镜台测微尺随着显微镜总放大倍数的放大而放大，因此从镜台测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小，所以用镜台测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表的长度，然后移去镜台测微尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物大小。2、 球菌用直径表示大小；杆菌用宽和长来表示。2、血球计数板测定微生物数量镜检计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质常不易分辨。菌目镜测微尺镜台测微尺图 2： 目镜测微尺和镜台测微尺的校准图 1山东大学实验报告 2014 年 11 月 30 日姓名 班级 13 级生命基地班 学号
5、同组者： 科目 微生物学实验 题目 微生物大小及数量的测定 组别 3第 3 页 共 9 页 微生物实验报告体较大的酵母菌或霉菌泡子可采用血球计数板；一般细菌则采用彼得罗夫霍泽(Petroff Hausser)细菌计数板。两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，故细菌不易看清。血球计数板是一块特制的厚载玻片，载玻片上有 4 条槽而构成 3 个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个方格网(图 3)。每个方格网共分 9 大格，其中间的一大格(又称为计数室)常被用作微生物的计数。计数室的刻度有两种：一种是大方格
6、分为 16 个中方格，而每个中方格又分成 25 个小方格；另一种是一个大方格分成 25 个中方格，而每个中方格又分成 16 个小方格。但是不管计数室是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即每个大方格都由 400 个小方格组成(图 4)。每个大方格边长为 1mm，则每一大方格的面积为 1mm2，每个小方格的面积为1400mm 2，盖上盖玻片后，盖玻片与计数室底部之间的高度为 0.1mm，所以每个计数室(大方格)的体积为 0.1mm3，每个小方格的体积为 l4000mm 3。计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上 25 或 16，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成
7、 1ml 菌液中的总菌数。 以 25 个中方格的计数板为例，设 5 个中方格中的总菌数为 A，菌液稀释倍数为 B，则：1mL 菌液中的总菌数=A/525104B=50000AB（个）同理，如果是 16 个中方格的计数板，1mL 菌液中的总菌数=A/516104B=32000AB（个）图 3 血球计数扳的构造a. 平面图(中间平台分为两半，各半边有一个方格网)b. 侧面图(中间平台与盖玻片之间有高度为 0.1 毫米的间隙)山东大学实验报告 2014 年 11 月 30 日姓名 班级 13 级生命基地班 学号 同组者： 科目 微生物学实验 题目 微生物大小及数量的测定 组别 3第 4 页 共 9
8、页 微生物实验报告c. 图 4 血球计数板计数网的分区和分格【实验内容及步骤】1、目镜测微尺的校正 把目镜的上透镜旋下（CX20、CX21 型号显微镜），将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入目镜的隔板上，把镜台测微尺置于载物台上，刻度朝上。先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，移动推动器，使两尺重叠，再使两尺的“0”刻度完全重合，定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度，计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数。因为镜台测微尺的刻度每格长 l0m，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的长度。两重合线间镜台测微尺格数1
9、0 目测尺每格长度（um）= 两重合线间目镜测微尺格数用此法分别校正在物镜倍数为 10，40，100下目镜测微尺每小格所代表的长度。由于不同显微镜及附件的放大倍数不同，因此校正目镜测微尺必须针对特定的显微镜和附件（特定的物镜、目镜、镜筒长度）进行，而且只能在特定的情况下重复使用，当更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须重新校正目镜测微尺每一格所代表的长度。2、细胞大小的测定A. 酵母菌的大小测定山东大学实验报告 2014 年 11 月 30 日姓名 班级 13 级生命基地班 学号 同组者： 科目 微生物学实验 题目 微生物大小及数量的测定 组别 3第 5 页 共 9 页 微生物实验报告1) 取一
10、滴酵母菌菌悬液制成水浸片。2) 移去镜台测微尺，换上酵母菌水浸片，先在低倍镜下找到目的物，然后在高倍镜下用目镜测微尺来测量酵母菌菌体的直径占几格（不足一格的部分估计到小数点后一位数）。测出的格数乘上目镜测微尺每格的校正值，即等于该菌的直径。3）选取普遍大小的酵母菌菌体进行测量，记录三组数据，取平均值。B. 枯草芽孢杆菌的大小测定1) 将载玻片洗净晾干后，在其中央滴一滴蒸馏水，然后通过无菌操作用接种针取少量枯草芽孢杆菌的斜面培养物于蒸馏水中，然后干燥2) 单染色用结晶紫染液对其进行单染色：流程如下：3) 置于显微镜下镜检，用目镜测微尺测量枯草芽孢杆菌的长和宽，测量菌体大小时要在同一个标本片上测定
11、 3 个大小相近的菌体，求出平均值，才能代表该菌的大小。而且一般是用对数生长期的菌体进行测定。3. 酵母菌菌悬液中酵母菌数量的测定1) 如果一个小方格内酵母菌过多，难以数清，应当对培养液进行稀释以便于酵母菌的计数。具体方法是：摇匀试管，取 1mL 酵母菌培养液，加入成倍的无菌水稀释，稀释 n 倍后，再用血球计数板计数，所得数值乘以稀释倍数。（本次实验中稀释倍数为 10 倍）2) 取洁净的血球计数板一块，在计数室上盖上一块盖玻片。3) 将酵母菌菌悬液充分摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的右上角滴入一小滴(不宜过多)，使菌液沿两玻片间自行渗入计数室，勿使产生气泡，并用吸水
12、纸吸去沟槽中流出的多余菌液。4) 先在低倍镜下找到计数区，再转换高倍镜观察并计数。5) 计数时若计数区由 16 个中方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的 4个中方格（即 100 小格）的菌数。如为 25 个中方格组成的计数区，除数上述四个大方格外，还需数中央 l 个大方格的菌数（即 80 个小格）。 6) 由于菌体在计数室中处于不同的空间位置，要在不同的焦距下才能看到，因而观察时必须不断调节微调螺旋，方能数到全部菌体，防止遗漏。加热、固定、干燥洗片、干燥涂片 染色水洗干燥镜检山东大学实验报告 2014 年 11 月 30 日姓名 班级 13 级生命基地班 学号 同组者： 科目 微
13、生物学实验 题目 微生物大小及数量的测定 组别 3第 6 页 共 9 页 微生物实验报告7) 如菌体位于中格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。8) 凡酵母菌的芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。若计数时不计芽体，最后要在结果中标明。9) 计算 1ml 菌液中菌数公式：A 5A:5 个中方格菌数和 B:稀释倍数10) 血球计数板使用后，用自来水冲洗，切勿用硬物洗刷，洗后自行晾干或用吹风机吹干，或用 95%的乙醇、无水乙醇、丙酮等有机溶剂脱水使其干燥。通过镜检观察每小格内是否残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复清洗直到干净为止。【实验结果】1、目镜测微
14、尺的标定结果2、酵母菌的大小测定结果物镜倍数（目镜均为 10 倍）目镜测微尺的格数（小格）镜台测微尺的格数（小格）目镜测微尺的每格的长度（um）10 倍 81 80 9.8840 倍 85 21 2.47100 倍 61 6 0.9810 倍镜观察结果酵母菌菌号 目镜测微尺格数 直径长度 um（长轴）1 0.8 7.902 0.8 7.903 0.8 7.90平均值 0.8 7.9025（或 16） 10 B酵母菌菌数/ml= 4山东大学实验报告 2014 年 11 月 30 日姓名 班级 13 级生命基地班 学号 同组者： 科目 微生物学实验 题目 微生物大小及数量的测定 组别 3第 7 页
15、 共 9 页 微生物实验报告3、枯草芽孢杆菌大小的测定（10100 ）枯草芽孢杆菌大小平均值 = 3.10 0.75 um4、血细胞计数板测定酵母菌数量结果（2516）实验次数每个方格中酵母菌菌数（芽孢不计入计数范围）总菌数 稀释倍数 1ml 菌液菌数(个）1 57.6 64 54.4 60.8 57.6 294.4 10 1.47210【实验小结】40 倍镜观察结果酵母菌菌号 目镜测微尺格数 直径长度 um（长轴）4 3.0 7.415 3.2 7.906 3.1 7.66平均值 3.1 7.66目镜测微尺格数 实际长度 um枯草芽孢杆菌菌号 长 宽 长 宽1 3 0.8 2.94 0.78
16、2 2.9 0.7 2.84 0.693 3.6 0.8 3.53 0.78平均值 3.2 0.8 3.10 0.758山东大学实验报告 2014 年 11 月 30 日姓名 班级 13 级生命基地班 学号 同组者： 科目 微生物学实验 题目 微生物大小及数量的测定 组别 3第 8 页 共 9 页 微生物实验报告在实验操作中，值得注意的地方：从容器中吸出酵母菌菌悬液进行计数之前，要将其轻轻震荡几下，这样使酵母菌分布均匀，防止酵母凝聚沉淀， 能提高计数的代表性和准确性，使求得的培养液中的酵母菌数量误差减小。另外在滴加菌悬液和压片的时候更要仔细小心，避免计数室有气泡产生。计数时，由于菌体在计数室中
17、处于不同的空间位置，要在不同的焦距下才能看到，因而观察时必须不断调节微调螺旋，方能数到全部菌体，防止遗漏。此外，在测量菌体大小时，由于细菌个体微小，应尽量使用油镜观察测量，以减少误差，在选择测量菌体对象时，应选取普遍大小的菌体进行测量，一般选取三个不同菌体取其平均值。最后，在观察结束后不能忘记将油镜镜头擦拭干净。【思考与讨论】1为什么更换不同放大倍数的目镜和物镜时必须重新用镜台测微尺对目镜微尺进行标定?答： 由于不同显微镜及附件的放大倍数不同，因此校正目镜测微尺必须针对特定的显微镜和附件（特定的物镜、目镜、镜筒长度）进行，而且只能在特定的情况下重复使用，当更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须重
18、新校正目镜测微尺每一格所代表的长度。比如：10X的目镜，4X 的物镜，总的放大倍数是 40X，长度是 5mm。现在把物镜换成 10X，总的放大倍数是 100X，长度也会因此而增长，所以要重新定标。2若目镜不变，目镜测微尺也不变，只改变物镜，那么目镜测微尺每格所测量的镜台上的菌体细胞的实际长度（或宽度）是否相同?为什么?答： 不相同，因为目镜测微尺上读的数值实际是目镜和物镜共同放大后的结果，现在物镜改变，数值改变。3 血球计数板计数误差来自哪些方面，应如何避免?误差来源：活细胞和死细胞不易分开，数出来的细胞是死活细胞的总和。取菌液前没有混合均匀，造成计数误差。加样时计数室有气泡产生。 避免方法：取样前要将酵母菌菌悬液震荡摇匀，使其混合均匀，否则细胞沉在试管底部，造成计数误差。在加样操作时，用滴管吸取少许菌悬液，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的右上角滴入一小滴(不宜过多)，使菌液沿两玻片间自行渗入计数室，勿使产生气泡，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌液。山东大学实验报告 2014 年 11 月 30 日姓名 班级 13 级生命基地班 学号 同组者： 科目 微生物学实验 题目 微生物大小及数量的测定 组别 3第 9 页 共 9 页 微生物实验报告
