1、实验一 玻璃仪器的清洗与包扎、干热灭菌,一、玻璃器皿的清洗和灭菌(一)、新购的玻璃器皿 1、先用热肥皂水刷洗，流水冲净。 2、再浸泡于的盐酸中数小时，最后用流水 冲净。,二、玻璃仪器的干热灭菌,(1)将培养皿、吸管等玻璃器皿洗净干燥后，用报纸包好，或装入特制的铁筒中。 (2)将包装好的玻璃仪器摆入电热烘箱中，彼此间留有一定的空隙以便流通空气。 (3)关紧箱门，打开排气孔接上电源。 (4)待箱内空气排出到一定程度时，关闭上排气孔，继续加热至一定温度后，调节温度控制旋钮固定温度，在160165保持2小时即可。 (5)待自然降温冷却后(60以下)才能开门取出玻璃器皿。,三、注意事项干热灭菌时电烘箱中
2、物品不要摆得太拥 挤，以免阻碍空气流通而影响灭菌效果；灭 菌物品不要与电烘箱内壁的铁板接触。以免 包装纸烤焦起火。,实验二 培养基的配制、分装和灭菌,一. 实验目的,明确培养基的配制原则；掌握配制培养基的一般方法和步骤；了解高压蒸汽灭菌的基本原理及应用范围；掌握高压蒸汽灭菌技术，了解几种常用灭菌方法。熟悉分离、培养微生物前的有关准备工作及操作方法。,二. 实验材料,药品：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂等。 仪器：高压蒸汽灭菌器、恒温干热灭菌箱。,其它：天平、牛角匙、电炉、1N NaOH、pH试纸、刻度搪瓷杯、量筒、漏斗、漏斗架、玻棒、带玻璃珠的三角瓶、带棉塞的无菌试管、无棉塞的空试管、培养皿、吸
3、管、各种包装纸、防水纸、绳索、棉花、标签等,（一）培养基的制备 （1）培养基是人工按一定比例配制的供微生物生长繁殖和合成代谢产物所需要的营养物质的混合物。培养基的原材料可分为碳源、氮源、无机盐、生长因素和水。根据微生物的种类和实验目的不同，培养基也有不同的种类和配制方法。 （2）制备流程：称量溶解蒸煮调pH分装包扎灭菌,三. 实验原理,(3)操作步骤：1）称药品 按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入大烧杯；也可放在称量纸上称量，随后放人热水中，牛肉膏便与称量纸分离，立即取出纸片。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。2）加热溶解 在烧杯
4、中加入少于所需要的水量，小火加热，并用玻棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基，则将称好的琼脂放入已溶解的药品中，再加热融化，此过程中需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补足所失的水分。,3）调pH 检测培养基的pH，若pH偏酸，可滴加1滴1molL-1NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸检测，直至达到所需pH范围。若偏碱，则用1molL-1HCl进行调节。pH的调节通常放在加琼脂之前。应注意pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。 4）过滤 液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁热过滤，以利结果的观察。但是供一般使用的培养基，该步可省略。,固体
5、分装,5）分装 披实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上面造成污染。分装量：固体培养基约为试管高度的15，灭菌后制成斜面。分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜。半固体培养基以试管高度的1/3为宜。灭菌后垂直待凝。,液体分装,试管,三角烧瓶,试管,三角烧瓶,1/3,1/4,1/2,1/5,1/2,6）加棉塞 试管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脱脂棉)制作的棉塞。棉塞的形状、大小和松紧度要合适，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用。要使棉塞总长约35塞入试管口或瓶口内，以防棉塞脱落。有些微生物需要更好的通气，则可用8层纱
6、布制成通气塞。有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞。 7）包扎 加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。 8）培养基的灭菌时间和温度，需按照各种培养基的规定进行，以保证灭菌效果和不损培养基的必要成份。培养基经灭菌后，必须放37温室培养24h，无菌生长者方可使用。,培养基分装,斜面制作,包扎成捆挂标签,（4）关键步骤及注意事项 要严格按配方配制。 调pH不要过头。 干热灭菌要注意物品不要堆放过紧，注意温度的时间控制，70C以下放物、取物。 高压灭菌要注意物品不要过多，加热后排除冷空气，到时降压回零取物。,（二）灭菌 灭菌：用物理或化学的方法杀灭物体上一切微生物。 （1）干热灭
7、菌法：把待灭菌的物品均匀地放入烘箱中，升温至160C，恒温1小时即可。此法适用于玻璃皿、金属用具等的灭菌。 （2）高压蒸汽灭菌法（一般121C，30min，适用培养基）：把待灭菌的物品放在一个可密闭的加压蒸汽灭菌锅中进行的，以大量蒸汽使其中压力升高。由于蒸汽压的上 升，水的沸点也随之提高。在蒸汽压达到1.055 公斤/厘米2时，加压蒸汽灭菌锅内的温度可达到121C。在这种情况下，微生物（包括芽孢）在1520 分钟便会被杀死，而达到灭菌目的。如灭菌的对象是砂土、石蜡油等面积大、含菌多、传热差的物品，则应适当延长灭菌时间。,高压蒸汽灭菌法 1加水 将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，以水面
8、与三角架相平为至。 2装料 将装料桶放回锅内，装入待灭菌的物品。装有培养基的容器放置时要防止液体溢出，瓶塞不要紧贴桶壁，以防冷凝水沾湿棉塞。 3加盖 将盖上与排气孔相连接的排气软管插人内层灭菌桶的排气槽内，摆正锅盖，对齐螺口，然后以同时旋紧相对的两个螺栓的方式拧紧所有螺栓，并打开排气阀； 4排气 加热。待水煮沸后，水蒸汽和空气一起从排气孔排出。一般认为，当水沸后约5min，表明锅内空气已排净。 5升压 当锅内空气排净时，即可关闭排气阀，压力开始上升。,6保压 当压力表指针达到所需压力刻度时，控制热源。开始计时并维持压力至所需时间。本实验用121，20min灭菌。 7降压 达到所需灭菌时间后，关
9、闭热源，让压力自然下降到零后，打开排气阀。放净余下的蒸汽后，再打开锅盖，取出灭菌物品，倒掉锅内剩水。 8无菌检查 将已灭菌培养基于37培养24h，无杂菌生长，即可待用。,注意事项：使用灭菌锅应严格按照操作程序进行，避免发生事故；灭菌时，操作者切勿擅自离开，务必待压力下降到零后，才可打开锅盖。,（3）间歇灭菌法：待灭菌的物品放在灭菌器或蒸笼里，每天蒸煮1次，每次煮沸1h，连续3d 重复进行。在每两次蒸煮之间，将物品（指培养基）放在37C恒温条件下培养过夜，这样可以使每次蒸煮后未杀死残留的芽孢萌发成营养体，以便下次蒸煮时杀灭。 （4）巴氏灭菌法：有些食物会因高温破坏营养成分或影响质量，如牛奶、酱油
10、、啤酒等，所以只能用较低的温度来杀死其中的病原微生物，这样既保持食物的营养和风味，又进行了消毒，保证了食品卫生。该法一般在62，30分钟既可达到消毒目的。此法为法国微生物学家巴斯德首创，故名为巴氏消毒法。,（三）棉塞的制作,微生物接种技术是进行微生物实验和相关研究 的基本操作技能。无菌操作是微生物接种技术的关键。斜面接种 、液体接种、固体接种和穿刺接种操作均以获得生 长良好的纯种微生物为目的。由于接种方法不同，采用的接种工具也有区 别，如固体斜面培养体转接时用接种环；穿刺接种 时用接种针，液体转接用移液管等。,实验三 微生物的接种技术,一、实验目的：了解各种微生物接种方法。二、实验材料和用具：
11、已灭菌培养基、接种环、接种针、酒精灯、移液管、记号笔,三、实验步骤： 1、斜面接种技术斜面接种是从已生长好的菌种斜面上挑取少量 菌种移植至另一新鲜斜面培养基上的一种接种方法 。具体操作如下： (1)贴标签 接种前在试管上贴上标签，注明菌名、接种日期、接种人姓名等。贴在距试管口约23cm的位置。(若用记号笔标记则不需标签)。 (2)点燃酒精灯。,(3)接种 用接种环将少许菌种移接到贴好标签的试管斜面上。操作必须按无菌操作法进行。 1)手持试管 将菌种和待接斜面的两支试管用大姆指和其他四指握在左手中。使中指位于两试管之间部位。斜面面向操作者，并使它们位于水平位置。 2)旋松管塞 先用有于松动棉塞或
12、塑料管盖，以便接种时拔出。 3)取接种环 右手拿接种环，在火焰上将环端灼烧灭菌然后将有可能伸入试管中的其余部分均灼烧灭菌，重复此操作，再灼烧一次。,4)拔管塞 用右手的无名指、小指和手掌边先后取下菌种管和待接试管的管塞，然后让试管口缓缓过火灭菌(切勿烧得过烫)。,试管拔塞后过火灭菌和取菌,5)塞管塞 取出接种环，灼烧试管口，并在火焰旁将管塞旋上。不要用试管去迎棉塞，以免试管在移动时纳入不洁空气。 6)将接种环灼烧灭菌。放下接种环，再将棉花塞旋紧。,2、液体接种技术 (1)用斜面菌种接种液体培养基时，有下面两种情况：如接种量小，可用接种环取少量菌体移入培养基容器(试管或三角瓶等)中，将接种环在液
13、体表面振荡或在器壁上轻轻摩擦把菌苔散开，抽出接种环，塞好棉塞，再将液体摇动，菌体即均匀分布在液体中。如接种量大，可先在斜面菌种管中注入定量无菌水接种环把菌苔刮下研开，再把菌悬液倒入液体培养基中，倒前需将试管口在火焰上灭菌。 (2)用液体培养物接种液体培养基时，可用无菌的吸管或移液管吸取菌液接种。,3、固体接种技术固体接种最普遍的形式是接种固体菌制剂。因所用 菌种或种子菌来源不同分为： 1)用菌液接种固体料 可用菌苔刮洗制成的悬液。接种时可按无菌操作法将菌液直接例入固体培养基中，搅拌均匀。注意接种所用菌液量要计算在固体料总加水量之内，否则往往在用液体种子菌接种后含水量加大，影响培养效果。 2)用
14、固体种子接种固体料 包括用孢子粉、菌丝孢子混合种子菌或其他固体培养的种子菌，直接把接种材料混入灭菌的固体料。接种后必须充分搅拌使之混合均匀。,4、穿刺接种技术穿刺接种技术是一种用接种针从菌种斜面上挑 取少量菌体并把它穿刺到固体或半固体的深层培养 基中的接种方法。经穿刺接种后的菌种常作为保藏 菌种的一种形式，同时也是检查细菌运动能力的一 种方法，它只适宜于细菌和酵母的接种培养。,具体操作如下。 (1)贴标签。 (2)点燃酒精灯。 (3)穿刺接种。 (4)将接种过的试管直立于试管架上，放在37或28恒温箱中培养。24h后观察结果(注意：若具有运动能力的细菌，它能沿着接种线向外运动而弥散，故形成的穿
15、刺线较粗而散、反之则细而密)。,(3)穿刺接种方法如下： 1)手持试管。 2)旋松棉塞。 3)右手拿接种针在火焰上将针端灼烧灭菌，接着把在穿刺中可能伸入试管的其他部位也灼烧灭菌。 4)用右手的小指和手掌边拔出棉塞。接种针先在培养基部分冷却。再用接种针的针尖沾取少量菌种。 5)接种有两种手持操作法。一种是水平法，它类似于斜面接种法。一种则称垂直法。尽管穿刺时手持方法不同，但穿刺时所用接种针都必须挺直，将接种针自培养基中心垂直地刺入培养基中。穿刺时要做到手稳、动作轻巧快速，并且要将接种针穿刺到接近试管的底部，然后沿着接种线将针拔出。最后，塞上棉塞，再将接种针上残留的菌在火焰上烧掉。,斜面划线法（a
16、） 不同细菌直线接种长出的菌苔形态（b）,穿刺接种 （a）水平穿刺接种；（b）垂直穿刺接种,四、实验报告 列表比较各种接种方法及注意事项。五、问题和讨论 1、斜面接种取菌前为什么要将灼烧过的接种针在无菌培养基上沾一下？ 2、穿刺接种时能否将接种针直接穿透培养基？,实验四 显微镜的使用和维护,（1）学习掌握显微镜的结构、功能和使用方法。 （2）学习并掌握显微镜的维护的基本知识。,一. 实验目的,二、显微镜的构造,1.光学部分:接目镜、接物镜、照明装置(聚光镜、虹彩光圈、反光镜等)。它使检视物放大,造成物象。 2.机械部分:镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、载物台转移器、粗调节器、细调节器等部
17、件。它起着支持调节固定等作用。,油镜使用的原理,镜头的识别低倍、高倍和油镜接物镜的识别方法，可直接 读它上面刻的倍数，简便方法是低倍镜较短，高倍 镜较长，油镜更长且上面刻有黑圈。使用时一定要 识别清楚，不可认错，否则在转换物镜时会碰压镜 头，损坏物镜的危险。放大倍数越高的接物镜它的 焦距越小，工作距离也越小，因此油镜观察时镜头 和玻片极为接近，使用时应该注意。,显微镜的使用,1.用前检查：零件是否齐全，镜头是否清洁。 2.调节光亮度 3.低倍镜观察：粗调、细调。 4.依次再进行中倍、高倍观察 5.油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，提升聚光镜，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细
18、调至看清物象为止。 6.换片：另换新片，必须从第三条开始操作。 7.用后复原：观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去镜头上的 油，然后再用擦镜纸沾取少量二甲苯擦去残留的油，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯，后将镜体全部复原。,1.用低倍镜观察酵母菌 (1)调节光源:将低倍物镜转到工作位置。上升聚光器，可变光阑完全 打开，然后转动反光镜采集光源，一般以采集北窗射入的自 然光为宜，不宜采用直射日光。如遇阴天或晚上可用普通日 光台灯照明。当用显微镜灯(钨丝灯泡)照明时，因其亮度较强，而且 发射光谱中有较多刺激眼睛的红光，故应根据标本染色情况 选用绿色、黄绿或蓝绿色滤光器或一面磨砂的有色滤光片， 以减弱光的强
19、度，同时又可吸收掉红光，使视野光线柔和， 并可护眼睛。旋转反光镜，使光线投射到反光镜中央，并调节聚光器 或调节光圈大小，使视野得到均匀的照明。,三. 实验步骤,（2)调节聚光镜和物镜数值孔径相一致，取下目镜直接向 镜筒内观察，先将可交光阑缩到最小，再轻轻地打开，便 聚光器的孔径与视野的直径一样大，然后再放回目镜。这 一操作的目的是使入射光所展开的角度与镜口角的角度相 符合，否则因光圈开得太大而超过物镜的数值孔径时，会 产生光斑，如光圈收得太小则降低分辨力，从面影响了物 像的清晰度。因为各物镜的数值孔径不同，所以每转换一 次物镜都要进行调节。在实际操作中观察者住往只根据视野的亮度和标本明 暗对比
20、度来侧节光圈大小，而不考虑聚光器与物镜数值孔 径的配合。只要能达到较好的效果，这种调节法也是可取 的。但是，对于使用显微镜的工作者来讲，必须了解这一 操作的目的和原理，这样在操作时就能运用自如。,(3)放置标本 上升镜筒，将酵母水封片放在镜台上，用玻 片夹夹住，然后降下低倍物镜，使其下端接近于玻片。 (4)调焦 转动粗螺旋，使镜筒逐渐上升到看见模糊物像时， 再转动细螺旋，调节到物像清晰时为止。 (5)观察 观察并绘制酵母菌形态。如要精细观察可转换高倍 镜。,2.高倍镜观察 （1）将在低倍镜下找到的合适部位移至视好当中。 （2）转换高倍镜 用手按住转换器慢慢地旋转，当听“咔嗦”一声即表物镜已转到
21、正确的工作位置上。 （3）调焦 使用齐焦物镜时，只要从低倍镜转到高倍镜再稍调一下细螺旋即可看清物像。如用不齐焦的物镜时，每转换一次物镜都要进行调焦，即先使物镜降至非常靠近玻片的位置然后再慢慢上升镜筒，并细心调节粗、细螺旋，直至物象清晰为止。 （4）观察:仔细地观察酵母菌的结构。,3.用油镜观察细菌(1)放置标本 将染色的细菌涂片置于镜台上。(2)找合适的视野 先用低倍镜寻找合适的视野，并将欲观 察的部位移到视野中央。(3)转换油镜，将油镜转到工作位置。(4)调节聚光器与油镜数值孔径相一致:只要将聚光器上升 到最高位置，可变光阑开到最大，此时两者的数值孔径即达到 一致。,(5)加香柏油 从双层瓶
22、的内层小管中取香柏油12滴加到 欲观察部位的徐片上(切勿加多)，然后将油镜转到工作位置， 下降镜筒，使油镜浸入香柏油中，并从侧面观察，使镜头降至 既非常接近玻片，又不能与玻片相撞的合适位置。(6)调焦 左眼从目镜中观察，同时转动粗螺旋(切忌反方 向旋转)，缓慢地提升油镜至出现模糊的物像时再用细螺旋调节 至物像清晰为止。如按上述操作还找不到目的物，一种可能是 油镜头下降还未到位，另一种可能是油镜上升太快，以至眼睛 捕捉不到一闪而过的物像。遇此情况，应重新操作。(7)观察 仔细观察细菌形态。,4.显微镜用毕后的处理 （1）上升镜筒取下玻片。 （2）清洁显微镜 清洁油镜：先用擦镜纸擦去镜头上的香柏油
23、，再用沾少许二甲苯的擦镜纸擦掉残留的香柏油，后再用干净的擦镜纸抹去残留的二甲苯。 清洁目镜和其他物镜：用擦镜纸擦净其他的物镜和目镜。 用柔软的绸布擦净机械部分的灰尘。 （3）清洁后应将物镜转成“八”字式，缓慢下降镜筒，使物镜 搁在镜台上。将聚光器降到最低位置，反光镜转成垂直状。 （4）去除细菌涂片上的香柏油 加23滴二甲苯于涂片上， 使香柏油溶解，再用毛边纸轻轻压在涂片上，吸掉二甲苯和香 柏油，以免损坏涂片。,5.注意事项 （1）搬动显微镜时应用右手握住镜臂，左手托住底座，使 镜身保持直立，并紧靠身体。切忌单手拎提。 （2）各个镜面切忌用手涂抹，以免手上的油、汗污损镜 面，造成日后发霉。 （3
24、）用二甲苯擦镜头时用量要少，不宜久抹，以防溶解胶 粘透镜的树脂。切勿用乙醇擦镜头和支架。 （4）因油镜的工作距离甚短，故操作时要特别谨慎，切忌 采用眼睛对着目镜边观察边下降镜筒的错误操作。,四.显微镜保养中的注意事项,1.不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。 2.镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度。 3.观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。 4.观察时，两眼睁开，养成两眼能够轮换观察的习惯，以免眼睛疲劳，并且能够在左眼观察时，右眼注视绘图。 5.拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜
25、座，不可单手拿，更不可倾斜拿。 6.显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐蚀镜片。,实验四 酵母菌的形态观察,目的要求认识酵母菌的形态结构，掌握其观察方法。实验程序观察酵母菌的形态,观察酵母菌的形态,菌落特征的观察： 取少量酿酒酵母划线接种在麦芽糖平板培养基上，2830培养35d。用肉眼观察菌落特征，项目包括菌落表面湿润或干燥、有无光泽、边缘形状、大小、颜色等 观察酵母菌形态和无性繁殖： 在洁净载玻片上滴加一滴无菌水或0.1美蓝液一滴，用接种环取菌苔少许与无菌水或美蓝液混匀，盖上盖玻片，即成为水浸片。用高倍镜观察啤酒酵母的形态和出芽繁殖。,实验结果,绘出酵母菌的形态图并注明各部位的名称
26、.,实验四 霉菌形态观察一、实验目的 1学习掌握插片法和水浸片法观察霉菌的方法。 2学习掌握低倍镜和高倍镜观察丝状菌体的技能。,二、实验内容,用水浸片法观察：青霉、曲霉的形态和分生孢子。根霉 的假根和孢囊孢子。霉菌菌丝一般可从培养体上直接调取，作成水浸片。 具体方法：在清洁载玻片中央，加蒸馏水一滴，用解针挑 取少量菌丝放入水滴中，这时两手各持针一支，将菌丝 分开，不使缠结成团。挑开菌丝后，轻轻加上盖玻片，注 意不要产生气泡，先用低倍镜后用高倍镜观察。,三、作业绘图、记录青霉、曲霉和根霉的形态。,实验五 染色与制片技术,一、实验目的学习微生物的染色原理、染色的基本操作技术，从而掌握微生物的一般染
27、色法和革兰氏染色法及细菌制片方法。,二、染色原理由于微生物细胞含有大量水分，对光线的吸收和反射与水溶液的差别不大,机体是无色透明的，与周围背景没有明显的反差,在普通光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。 微生物细胞是由蛋白质、核酸等两性电解质及其他化合物组成。所以，微生物细胞表现出两性电解质的性质。两性电解质兼有碱性基和酸性基，在酸性溶液中离解出碱性基呈碱性带正电。在碱性溶液中离解出酸性基呈酸性带负电。经测定，细菌等电点pH在25之间，故在中性、碱性或偏酸性溶液中，细菌的等电点均低于上述溶液的pH值，所以细菌带负电荷，
28、容易与带正电荷的碱性染料结合，故用碱性染料染色的较多。微生物体内各结构与染料结合力不同，故可用各种染料分别染微生物的各结构以便观察。,三、染色方法 (一)简单染色法微生物不但个体微小，且无色半透明。要在显微镜下观 察清楚，必须染上颜色 。微生物细胞中含有大量的蛋白质等 一类两性电解质：在酸性溶液中结合质子带正电；在碱性溶液 中给出质子而带负电。等电点一般在pH=25。所以，在中性、 碱性或弱酸性溶液中，微生物细胞通常带负电荷。碱性染料在 电离时，染色部分是带正电荷的，容易与带负电荷的菌体结合 使之着色。经染色后的菌体细胞与背景形成鲜明的对比，在显 微镜下很容易观察。简单染色法又叫作普通染色法，
29、只用一种染料使细菌染上颜色，如果仅为了在显微镜下看清细菌的形态，用简单染色即可。简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态的方法难于辨别细菌细胞的构造。,三、染色方法 (二)复染色法用两种或多种染料染细菌，目的是为了鉴别不同性质的细菌，所以又叫鉴别染色法。主要的复染色法有革兰氏染色法和抗酸性染色法。革兰氏染色法不仅能观察到细菌的形态，而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。细菌对革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成份和结构不同而造成的。,三、染色方法 (二)复染色法革兰氏染色法将细菌
30、分为G和G-，这由两类细菌细胞壁的结构和组成的不同而决定。用结晶紫初染后，所有的细菌都染上蓝紫色。碘作为媒染剂能与结晶紫结合形成结晶紫-碘的复合物，增强了染料与菌体的结合力。用乙醇脱色处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。G细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，且壁厚、类脂含量低，用乙醇脱色时使细胞壁脱水、网状结构孔径缩小，通透性降低，使得结晶紫碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内。虽经洗脱和复染仍然保持初染剂的蓝紫色。G-细菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄，类脂含量高，所以在脱色处理时，类脂被乙醇溶解，细胞壁的通透性增大，使结晶紫碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复
31、染剂的颜色。,四、压滴法制片技术 （1）将洁净无油腻的载片放于自己右边前方，在中央放一小滴无菌水。 （2）将酒精灯放于自己正前方，点燃。 （3）用无菌操作方法从枯草芽孢杆菌斜面中沾取少量菌体，与载片上的水滴充分混匀，把接种环上残留的菌体杀灭后，放回试管架。 （4）用镊子夹一洁净的盖玻片，使其一边先接触菌液然后将整个盖玻片慢慢放下，注意不要产生气泡。如菌液过多，可用吸水纸适当吸去一部分。 （5）先用低倍镜然后转用高倍镜观查，观察时光线要适当调暗些。,压滴法制片示意图,五、实验材料 1.显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、接种环、载玻片、酒精灯等。 2.石炭酸复红染液、草酸铵结晶紫染液、碘液、
32、95乙醇、蕃红染液 3.菌种：金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌,六、实验内容与步骤 (一)细菌的简单染色步骤涂片干燥固定染色水洗干燥镜检 1涂片取干净的载玻片于实验台上，在载玻片的中央滴一滴无菌蒸馏水，将接种环在火焰上烧红，待冷却后从斜面挑取少量菌种(金黄色葡萄球菌或枯草杆菌)与玻片上的水滴混匀后，在载玻片上涂布成一均匀的薄层，涂布面不宜过大。 2干燥涂片最好在室温下使其自然干燥，有时为了使之干得更快些，可将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。,3固定固定常常利用高温，手持载玻片的一端，标本向上，在酒精
33、灯火焰外层尽快的来回通过23次，共约23秒钟，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫为宜（不超过60）,放置待冷后，进行染色。 4染色在涂片薄膜上滴加染色液(石炭酸复红、草酸铵结晶紫或美蓝任选一种)一滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min。 5水洗斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。 6干燥用吸水纸吸去涂片边缘的水珠，置于室温下自然干燥。用吸水纸时切勿将菌体擦掉。 7镜检用显微镜观察，并用铅笔绘出细菌形态图。,单染色方法,(二)细菌的革兰氏染色步骤涂片干燥固定初染水洗媒染水洗脱色水洗复染水洗干燥观察1取大肠杆菌和枯草杆菌(均以无菌操作)分别做涂片、干燥、固定，方法
34、均与简单染色的相同。 2用草酸铵结晶紫染色1min后水洗。 3加碘液媒染1min后水洗。 4斜置载玻片，滴加95乙醇脱色，至流出的乙醇不现紫色 为止，大约需时2030s，随即水洗。 5用蕃红染液复染1min，水洗。 6用吸水纸吸掉水滴，待标本片干后置显微镜下，用低倍镜观察，发现目的物后用油镜观察，注意细菌细胞的颜色。绘出细菌的形态图并说明染色结果。,七、注意事项,1革兰氏染色成败的关键是脱色时间，如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而被误认为革兰氏阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被误认为是革兰氏阳性菌。因此必须 严格把握脱色时间。,2. 选用培养1824小时菌龄的细菌为宜，若细菌太老，由
35、于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。,八、实验结果简单染色： 金黄色葡萄球菌和枯草杆菌染成（ ）色。 革兰氏染色（大肠杆菌与枯草杆菌）：将结果填于下表中,4-1,实验七 微生物细胞的计数 （显微镜直接计数法）,一.目的 1.了解血球计数板的计数原理，掌握血球计数板的计数方法。 2.观察酵母菌的形态，学习区分酵母菌死活细胞的方法。 二.实验器材 显微镜、血球计数板、酵母菌液、美蓝染液、盖玻片,4-2,三原理 1. 血球计数板计数原理,血球计数板是一块特制的载玻片，有四条竖槽和一条横 槽。横槽两边的平台上各有一个有九个大方格的方格网，中 间大方格为计数室：边长为mm，深为0.1mm，容积
36、为 0.1mm3(10-4ml)。计数室有两种规格：一是分为16个中方 格，每中方格中有25个小方格；另一种是分为25个中方格， 每中方格有16个小方格。两种都共有400个小方格。,4-2,4-3,计数： 数出5个中方格中的总菌数A，若菌液的稀释倍数为B，则计算公式如下：,(1) 25个中方格的计数板计算公式(2) 16个中方格的计数板计算公式,2. 区分酵母菌死活细胞基本原理美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型是无色。用美蓝对酵母菌的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变成无色的还原型。因此，具有还原能力的酵母活细胞是无色的或
37、淡蓝色，而死细胞或代谢作用的衰老细胞则呈蓝色，借此即可对酵母菌的死细胞和活细胞进行鉴别。,四. 实验内容,1. 酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴别(1) 在载玻片上加半滴美蓝染液，在染液上滴一滴菌液。取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下盖在菌液上。(2) 将标本片放3分钟后，先用低倍镜然后用高倍镜观察酵母菌的形态和出芽情况，并根据颜色来区别死活细胞。,4-4,2. 酵母菌液的计数,(1) 镜检计数室 对计数板进行镜检。若有污物，则用自来水冲洗，用电吹风吹干后才能进行计数。 (2) 加样品 在血球计数板上盖上盖玻片, 用滴管将摇匀的酵母菌液由盖玻片边的小槽滴一小滴,菌液会自动进入
38、计数室，静置5分钟。 (3) 计数 将血球计数板置于载物台上，先用低倍镜找到计数室的位置，再换高倍镜计数。每计数室计5个中格（四角和中间）。计数原则：计上不计下，计左不计右。芽体占母细胞一半时算一个。 (4) 清洗血球计数板 计数后将血球计数板用自来水冲洗干净，勿用硬物刷，吹干后镜检。若不干净，则必须重复洗涤干净为止。,4-5,五. 结果记录 1.,2.酵母菌死活细胞的比例？ 六. 思考题 用此法计数的结果是活菌体还是死、活菌体的总和？,实验七 水中大肠菌群(Coliform group)细菌的检测,一、实验目的 了解大肠菌群的检测方法。,二、材料与器皿()培养基1、普通乳糖蛋白胨培养液 蛋白
39、胨 10g 牛肉膏 3g 乳糖 5g 氯化钠 5g 1.6溴甲酚紫乙醇液 1.0mL 蒸馏水 1000mL pH 7.27.4,将蛋白胨、牛肉膏、乳糖、氯化钠加热溶解于1000mL蒸馏水中，调节pH为7.27.4，再加入1.6溴甲酚紫乙醇液1.0mL，充分混匀，分装于有杜汉氏小管的试管中，每管10mL，115灭菌20min。2、三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液按上述普通乳糖蛋白胨培养液浓缩三倍配制，分装于有杜汉氏小管的试管中，每管5mL。,3、品红亚硫酸钠培养基（供平板分离用）蛋白胨 10g乳糖 10gK2HPO4 3.5g琼脂 1520g蒸馏水 1000mL无水亚硫酸钠 5g左右5的碱性品红乙醇溶液
40、 20mLpH 7.27.4,4、伊红美蓝培养基（EMB培养基）（供发酵法平板分离用，3和4可任选一种） 蛋白胨 10g 乳糖 10g K2HPO4 2.0g 琼脂 20g 蒸馏水 1000mL 2伊红（曙红）水溶液 20mL 5美蓝（亚甲蓝）水溶液 13mLpH 7.27.4,(二)灭菌移液管、灭菌稀释水、试管、杜汉氏小管、革兰氏染色液、灭菌培养皿。 三、方法与步骤 (一)水样的采集 供细菌学检验的水样，必须按一般无菌操作的基本要求采集，并保证再运送、贮存过程中不受污染。水样从采集到检验不应超过4小时，在04下保存不应超过24小时，如不能在4小时内分析，应在检验报告上注明保存时间和条件。,（
41、1）自来水取样：应在水龙头打开放水5分钟，再用无菌容器接取水样，待分析。如水样内含有余氯，则采样瓶灭菌后按每500mL水样加3Na2S2O3.5H2O溶液1mL。江、河、湖、池自然水体取样：可用采样器，采样瓶应先灭菌。采样后，瓶内应留有空隙。如果与其他化验项目联合取样，细菌学分析水样应采在其他样品之前。,（二）初发酵试验 水样稀释：制备水样10-1、10-2的稀释液，方法为用无菌移液管吸取水样10mL放于盛有90mL无菌水和若干玻璃珠的锥形瓶中，充分振荡使混合均匀，并使其中的细菌尽量呈单个存在，即为10-1稀释液；再从10-1制备10-2稀释液。以此类推，稀释到所需倍数。,（2）接种和培养：以
42、无菌操作于5支三倍浓缩培养基（接种前一定应先检查杜汉氏小管内有无气泡）中各加入水样10mL，5支普通培养基试管中加入水样1mL，5支普通培养基试管中加入10-1稀释液1mL， 小心混匀放入37培养箱中培养24小时。此即5管法。（3） 结果观察：37中培养24h后取出观察，观察有无气体（杜汉氏小管内有无气体）和酸产生（培养基有无变色）。在48h之间，培养管内倒置的杜汉氏小管内有任何量的气体积累，或培养基颜色从紫色变为黄色，便可初步断定为阳性反应。,若实验所测定的15支管中均为阳性反应，说明浓水样污染严重，可将样品进一步稀释后，再按上述方法接种、培养和观察。(三)平板培养试验将初发酵实验中产酸产气
43、的后只产酸或只产气的试管中的培养物用接种环取少许，划线接种在品红亚硫酸钠培养基或伊红美蓝培养基平板上，为了确保获得分离的单菌落，须注意以下事项：,（1）划线间距至少相隔0.5厘米； （2）接种钉尖端要稍弯； （3）先对试管轻击并使之倾斜，以免接种针挑取到任何膜状物或浮渣； （4）划线时要用针尖的弯曲部分接触琼脂培养基平面以免刮伤或戳破培养基。划线后培养皿倒置，于37培养1824h。,24h后，观察在平板上出现的单个菌落，其核心有深绿色金属光泽者为较典型的大肠菌群菌落。尽可能挑取典型的或接近典型的大肠菌群菌落，在营养琼脂斜面上划线，置37培养24h。挑取斜面培养物制成涂片，进行革兰氏染色，凡属革
44、兰氏阴性杆菌，即确认了大肠菌群细菌的存在,(四)复发酵验证实验经上述经染色为革兰氏阴性的典型菌落，用接种环刮取部分接种于盛有乳糖培养基的试管中，在37培养24h，阳性反应者即确认为大肠菌群细菌。,四、结果计算 在初发酵试验中，可能有极少数能发酵乳糖产气的非大肠菌群细菌混在阳性可疑反应管中，通过对初发酵中的阳性可疑管进行平板和复发酵试验，并进行革兰氏染色和细菌形态的观察，可将那些少量的非大肠菌群细菌(“假阳性管”)删除去，故在记录时只能把三步试验都呈阳性的试管计入阳性反应管。,如果初发酵接种水样量为10mL、1mL、0.1mL，可直接查表42求出原水样100mL中大肠菌群指数（MPN）。如果接种水样量低于上述水样量，则经下面的换算式计算。 目前我国系以1L水样中的菌数为报告值，即为MPN10。,目前我国系以1L水样中的菌数为报告值，即为MPN10。,表42水样的总大肠菌群检索表,下略,五、实验报告 1、 简述实验过程。 2、计算实验结果。 六、问题与思考实验过程中有什么问题，你认为原因何在，如何克服？,
