1、His-菌株的筛选,1.实验目的,观察亚硝酸对大肠杆菌的诱变效应 学习并掌握化学诱变育种的方法,2.实验原理,野生型菌株经过人工诱变或自然突变失去合成某种营养的能力，只有在基本培养基中补充所缺乏的营养因子才能生长。 经过诱变后的菌株，缺陷型很少必须淘汰野生型细胞，提高缺陷型细胞所占比例，达到浓缩缺陷型的目的。青霉素只杀死生长的细胞，对不生长的细胞不影响，所以在基本培养基中加入青霉素可以达到浓缩缺陷型细菌的目的。 检出缺陷型的方法有很多，这里主要以影印培养法为例进行说明。,3.实验材料、培养基与器材,材料：野生型大肠杆菌 培养基：基本培养基（minimal medium，MM）：仅能满足微生物野
2、生型菌株生长需要的培养基；完全培养基（complete medium，CM）：凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基；肉汤培养液 ；补充培养基（supplemental medium，SM）：在基本培养基中加入组氨酸营养因子。 器材：灭菌培养皿、灭菌离心管、移液枪、酒精灯、接种环。,四.实验步骤,1.菌液制备 把培养好的野生型大肠杆菌制成菌液，吸取5ml的菌液与离心管中，离xin（3500r/min）10min,倒去上清液，打匀沉淀。 2.诱变处理 吸取亚硝酸溶液5ml于离心管中，37处理40s,再加入10mlpH8.6的0.07molNa2HPO4溶液以终止亚硝酸的反应。 将
3、上述菌液吸取3ml接种于盛有3ml肉汤培养液的试管中，置37培养过夜。,3.营养缺陷型的浓缩,吸4.5ml处理过的菌液于以灭菌过得离心管，离心（3500r/min）10min。 倒去上清液，打匀沉淀，加入生理盐水4.5ml，离心洗涤三次，加入生理盐水到原体积。 吸取经离心洗涤的菌液0.1ml于5ml无N基本培养液，37培养12h。 然后按1：1加入2N基本培养液5ml，称取青霉素钠盐，使青霉素在菌液中的浓度约为1000单位/ml,再放入37恒温箱中培养18h。,4.营养缺陷型的检出,（1）将较小平皿直径小1cm的金属圆筒蒙上一层灭菌的丝绒，用金属夹夹住，灭菌。 （2）完全培养基上长出的全部菌落
4、在丝绒上轻轻一压，使之成为印模，标记方位。 （3）将培养基平皿和完全培养基平皿在标记的同一方位上先后轻轻一压，此菌印模即复印于上。 （4）将CM和MM在恒温箱中培养。 （5）二平皿相同方位进行比较，即可发现在MM平皿上长出菌落少于CM平板上的。MM上未长而相应于CM上长出的那几个菌落就可能是缺陷型。 此方法要求平皿上菌落不能太多，菌落之间应有一定间隔。,5.组氨酸营养缺陷型的鉴定,将可能是缺陷型的菌落接种于盛有5ml肉汤培养液的离心管中，37培养14-16h。 然后离心（3500r/min）10min,倒去上清液，打匀沉淀，然后离心洗涤三次，最后加入1ml生理盐水。 将离心洗涤的菌液用接种环分别划线于只加了组氨酸的基本培养基、基本培养基、完全培养基中，然后置于37恒温箱中培养24-48h，观察结果，找出组氨酸缺陷性菌。,Thank You!,
