1、仪器分析,第四章 荧光分析法,学习目的通过学习荧光分析法的基本原理、荧光分光光度计构造及荧光分析的新技术等内容，达到熟悉荧光分析法在药物分析中应用的目的。学习要点激发光谱、荧光光谱；产生荧光的条件；荧光强度的影响因素；荧光法分析条件的选择；荧光法的定量依据及适用条件。,目 录,第一节 荧光分析法的基本原理第二节 荧光分光光度计第三节 荧光分析法分析条件的选择第四节 荧光分析法的应用,一、荧光发现16世纪人们观察到当用紫外和可见光照射到某些物质时，这些物质就会发出不同强度和不同颜色的光，而当照射停止时，物质的发光也随之很快消失。直到1852年，Stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光光度计
2、观察到其荧光的波长比入射光的波长稍微长些，才判断这种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光，从而导入了荧光是光发射的概念。,概述,二、分子发光的类型1、按激发的模式分类：2、按分子激发态的类型分类：,光致发光 化学发光 热致发光 场致发光,三、荧光分析法的特点 1、灵敏度高 2、选择性强 3、工作曲线线性范围宽,一、分子荧光的产生 二、激发光谱与荧光光谱 三、荧光与分子结构的关系 四、影响荧光强度的外部因素,第一节 荧光分析法的基本原理,（一）分子中电子能级的多重性 （二）荧光的产生 1、振动弛豫 2、内部能量转换 3、荧光发射 4、外部能量转换 5、体系间跨越 6、磷光发射,一、分子
3、荧光的产生,电子的多重态是一种电子的运动状态，用M=2s+1表示，s为各电子自旋量子数的代数和其值为0或1。若分子中所有电子都是自旋配对的，则s=0，M=1，该分子处于单重态，用S表示。 大多数有机化合物分子的基态都处于单重态。,（一）分子中电子能级的多重性,电子激发态的多重态M=2S+1,基态分子吸收能量后，若电子在跃迁过程中不发生自旋方向的变化，仍然是M=1，分子处于激发的多重态，用S*表示。 若电子在跃迁过程中伴随自旋方向的变化，分子中便具有两个自旋不配对的电子，s=1，M=3，分子处于激发的三重态，用T1*表示。 S*与T1*的区别在于电子自旋方向不同， T1*能级较S*稍低一些。,（
4、一）分子中电子能级的多重性,电子激发态的多重态M=2S+1,S2*,S1*,S0,T1*,吸 收,发 射 荧 光,发 射 磷 光,系间跨越,内转换,振动弛豫,能 量,l 2,l 1,l 3,外转换,l 2,T2*,内转换,振动弛豫,（二）荧光的产生,处于激发态的分子是不稳定的，它可通过辐射跃迁和非辐射跃迁的形式释放多余能量而返回基态。 辐射跃迁主要涉及荧光、延迟荧光、磷光发射。 无辐射跃迁指以热的形式释放多余的能量，包括振动弛豫、内部能量转换、体系间跨越、外部能量转换。,（二）荧光的产生,振动弛豫,无辐射跃迁,1、荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级基态（多为S1S0跃迁），发射波长2
5、 的荧光。 2、磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级基态（T1S0跃迁） 。,（二）荧光的产生,3、振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-12s。 4、内转换：同多重态电子能级中，等能级间的无辐射能级交换的过程。 通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。,（二）荧光的产生,5、外转换：激发分子与溶剂或其他溶质分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁。 外转换使荧光或磷光减弱或“淬灭”。 6、系间跨越：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。,（二）荧光的产生,（一）激发光谱与荧光光谱
6、 （二）荧光光谱特征,二、激发光谱与荧光光谱,荧光强度：指发射荧光的光的强度。 荧光强度F与荧光物质浓度c，激发光强度I0的关系为 F=fI0(1-10-bc) 其中f为荧光量子产率，为摩尔吸光系数，b为液池厚度。 该式表明荧光强度与量子产率成正比，但与荧光物质浓度没有直线关系。 稀溶液时，上式简化为 F=2.3fI0bc= Kc 此时，荧光强度与荧光物质浓度成正比。,（一）激发光谱与荧光光谱,1、激发光谱曲线（Fex曲线） 固定荧光的发射波长(即测定波长), 改变入射光波长,得到荧光(磷光)强度与入射光波长的关系曲线。 2、荧光光谱（Fem曲线） 固定激发光波长(入射光波长), 改变荧光的测
7、定波长(发射波长),得到荧光强度与发射光波长关系曲线。,（一）激发光谱与荧光光谱,硫酸奎宁的激发光谱（a）及荧光光谱（b）,1、Stokes位移 指相同电子跃迁在吸收光谱和发射光谱中最强波长间的差值。 发射光谱的波长比激发光谱的长，由于振动弛豫等原因消耗了能量。,（二）荧光光谱特征,2、荧光光谱的形状与激发波长无关 一般情况下，用不同波长的激发光来激发荧光分子，得到的荧光发射光谱的形状基本相同。 原因：荧光均由第一激发态 的最低振动能级返回基态产 生的。,不同激发波长下维生素B2荧光光谱图,（二）荧光光谱特征,3、荧光光谱与激发光谱成镜像关系 激发光谱与荧光光谱形状相似，存在“镜像对称”关系。
8、,（二）荧光光谱特征,室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱,（二）荧光光谱特征,（一）荧光效率 （二）荧光寿命 （三）分子结构与荧光的关系,三、荧光与分子结构的关系,荧光效率也叫荧光量子产率,指物质发射荧光的量子数与所吸收的激发光量子数的比值，用f表示：荧光素钠在水中f =0.92；在乙醇中蒽f =0.30、菲f =0.10。 荧光效率低的物质，虽有强紫外吸收，但没有荧光发射。,（一）荧光效率,指除去激发光源后，荧光强度降低到最大荧光强度的1/e所需的时间，用f表示。F0为激发时的荧光强度，Ft为激发后时间t的荧光强度，以ln(F0/Ft)对t作直线，直线的斜率即为1/ f 。,（二）荧光寿命,分
9、子产生荧光必须具备的条件： （1）强的紫外-可见吸收； （2）具有一定的荧光量子产率。 分子结构对荧光起决定作用。 1、共轭结构 2、分子的刚性平面结构 3、取代基效应,（三）分子结构与荧光的关系,1、共轭效应 产生荧光的有机物质，都含有共轭双键体系，共轭体系越大，离域大键的电子越容易激发，荧光与磷光越容易产生。,（三）分子结构与荧光的关系,2、刚性平面结构 荧光物质的刚性和平面性增加，荧光效率越大，荧光波长发生长移。,芴,联二苯,F=1.0,F=0.2,红色荧光,弱荧光,（三）分子结构与荧光的关系,Mg2+,萘,维生素A,8-羟基喹啉,3、取代基效应 （1）给电子取代基加强荧光 如： HN2
10、， NHR ， NR2， OH， OR ， CN （2）吸电子取代基减弱荧光如：C=O， COOH ， NO2 （3）与电子共轭体系作用较小的取代基，对荧光影响不明显。 如：SO3H， NH3+ ， R,（三）分子结构与荧光的关系,（一）溶剂的影响 （二）温度的影响 （三）pH值的影响 （四）散射光的影响 （五）荧光熄灭剂的影响,四、影响荧光强度的外部因素,1、溶剂的极性： 对许多共轭芳族化合物，激发时发生了 * 跃迁，其激发态比基态具有更大的极性，随着溶剂极性的增大，激发态比基态能量下降的更多，荧光光谱向长波移动。 2、氢键 溶剂形成氢键的能力增大，荧光光谱向短波移动。 3、溶剂黏度 介质黏
11、度的提高，将减小激发态分子振动和转动的速率，同时降低与其他溶质分子的碰撞概率，有利于提高荧光或磷光的强度。,（一）溶剂的影响,温度上升，将使激发态分子的振动驰豫和内转化作用加剧，同时增大了发光分子与溶剂分子碰撞失活的机会，将导致溶液荧光和磷光效率和强度下降。 荧光素钠的乙醇溶液，在0以下，每降低10，f增加3%，在-80时，f为1。,（二）温度的影响,对酸碱型荧光物质，在不同的溶液pH下，荧光物质的存在形式不同，因而具有不同的荧光。,（三）pH值的影响,散射光分为瑞利光和拉曼光。 瑞利光：指光子和物质分子相碰撞时，不发生能量的交换，光子的频率并未改变，只是光子运动方向发生改变的散射光。 拉曼光
12、：指光子和物质分子相碰撞时，有部分光子和物质分子发生非弹性碰撞，在光子运动方向发生改变同时，光子把部分能量转移给物质分子或从物质分子获得部分能量的交换，光子频率发生改变的散射光。,（四）色散光的影响,散射光对荧光测定有干扰，选择适当的激发波长可消除 。,（四）色散光的影响,1、荧 光 熄 灭（荧光淬灭） 指荧光分子与溶剂分子或其它溶质分子相互作用引起荧光强度降低或消失的现象。 2、荧光熄灭剂 指能与荧光物质分子发生相互作用而引起荧光强度下降的物质。 如卤素离子、重金属离子、氧分子、硝基化合物、重氮化合物、羰基化合物等。 3、荧光熄灭类型 (1)碰撞淬灭；(2)生成化合物的淬灭(静态淬灭)；(3
13、)能量转移淬灭；(4)氧的淬灭；(5)转入三重态的淬灭；(6)浓度过大引起的自淬灭。,（五）荧光熄灭剂的影响,一、荧光分光光度计 （一）光源 （二）单色器 （三）样品池 （四）检测器 （五）信号显示记录器 二、荧光分析新技术简介 （一）同步荧光分析法 （二）三维荧光分析法 （三）时间分辨荧光分析法,第二节 荧光分光光度计,一、荧光分光光度计,光源,氙灯,激发单色器,样品池,光电倍增管,数据处理 仪器控制,发射单色器,（一）光源 氙灯，发射强度大，250nm700nm范围内的连续光谱，300400nm波段内的谱线强度几乎相等。 （二）单色器 两个光栅单色器。 激发单色器置于样品池前，用于选择激发
14、光的波长； 发射单色器置于样品池和检测器间，用于选择荧光发射波长，并消除其他杂散光的干扰。,一、荧光分光光度计,（三）样品池 通常用低荧光的石英材料制成，四面均为磨光透明面，厚度1cm。 问题：紫外-可见分光光度计的吸收池与荧光分光光度计的样品池有什么异同？ （1）样品池的材料：与紫外-可见分光光度计的吸收池一样。 （2）吸收池的形状：紫外-可见分光光度计吸收池两面透光， 荧光分光光度计样品池四面透光。 （3） 使用注意事项：波长范围、容易破碎、沾污问题。,一、荧光分光光度计,（四）检测器 光电倍增管，电感耦合器件（CCD）。 放大倍数：2n5n（n=10），103107， 最大108109（
15、五）信号显示记录器 计算机光谱工作站，对数字信号进行采集、处理、显示，并对各系统进行自动控制。,一、荧光分光光度计,（一）同步荧光分析法 （二）三维荧光分析法 （三）时间分辨荧光分析法,二、荧光分析新技术,该法同时扫描激发和发射两个单色器波长，由测得的荧光强度信号与对应的激发波长构成光谱图。 有如下方式： 固定波长差同步扫描法。 固定能量差同步扫描法。 可变波长（可变角）同步扫描法。,（一）同步荧光分析法,固定波长差同步扫描法。 3种芬芳族化合物p-terphenyl、anthracene和 perylene混合。 在一个固定的激发光下，发射光扫描(蓝色曲线)不能显示混合物中的组成。 20nm
16、间隔的同步扫描(黑色曲线)在3种物质各自发射光值最大时，显示出3段明显的波峰。,（一）同步荧光分析法,固定能量差同步扫描法。,可变波长（可变角）同步扫描法。,（一）同步荧光分析法,特点：简化谱图，减小了谱图重复现象和散射光的影响，提高选择性；但损失了其它光谱带，提供的信息量减少。 适合多组分混合物的分析，可应用于不同基因的分型、正常细胞与肿瘤细胞的区分等。,（一）同步荧光分析法,该法描述荧光强度同时随激发波长和发射波长变化关系的谱图，能提供比常规荧光光谱和倒数荧光光谱更完整的光谱信息。 可用于某些癌细胞的荧光代谢物的检测，以区分癌细胞与非癌细胞。,（二）三维荧光分析法,利用稀土配合物具有长寿命
17、荧光，在样品被脉冲光激发后、荧光信号采集前，根据样品中所包含的荧光物质荧光寿命的不同引入一定的延迟时间 (delay time) ，待短寿命的背景荧光完全淬灭后，再对长寿命的特异性荧光信号进行测定。 该法以具有独特荧光特性的镧系元素及其螯合剂作为示踪物，可标记抗体、抗原、激素、多肽、蛋白质、核酸探针及生物细胞。,（三）时间分辨荧光分析法,镧系金属离子螯合物的荧光寿命（微秒级）较长，通过时间分辨方式可以区别于传统短荧光寿命的背景荧光（纳秒级），可完全消除背景荧光的干扰。 镧系金属离子螯合物的荧光很宽的Stoke位移（200nm以上）使其容易通过波长分辨方式进一步区别于背景荧光，可提高方法学的稳定
18、性。 镧系金属离子螯合物狭窄的荧光发射峰（半峰宽1015 nm ）使其荧光检测具有很高的效率，提高了检测的特异性和灵敏性。,（三）时间分辨荧光分析法,第三节 荧光分析法分析条件的选择,一、激发波长与荧光波长的选择 二、空白溶液的选择 三、荧光强度与浓度的关系 四、定量分析方法的选择,一、激发波长与荧光波长的选择,1、查阅文献，了解其是否产生荧光； 2、扫描其紫外-可见吸收光谱，找到最大吸收波长； 3、在最大吸收波长进行荧光激发，测定其发射光谱，找到荧光发射最大的波长； 4、以发射最大波长作为发射波长，测定激发光谱，找到最大激发波长。 5、选择在最大激发波长和最大发射波长处进行物质测定。,二、空
19、白溶液的选择,1、溶剂空白 用溶剂做空白溶液，简称溶剂空白。 2、试剂空白 按照与显色反应相同的条件（不加样品），同时加入各种试剂和溶剂作为空白溶液，称为试剂空白。 3、平行操作空白 用不含待测组分的样品，按照与样品分析相同的条件与样品平行操作，称为平行操作空白。,F=2.3fI0bc= Kc F=2.303KI0Elc=Kc EL=Vhv F为荧光强度，I0为入射光强度，I为通过厚度为l的介质后的光强度，K为常数（取决于荧光效率f和检测系统灵敏度）。 在低浓度时，荧光强度与物质浓度成正比关系。 在高浓度时，由于淬灭和自吸等原因使荧光强度和浓度之间不成线性关系。,三、荧光强度与浓度的关系,（一
20、） 单组分的荧光测定1、直接测定法 2、间接测定法 （二）多组分混合物的荧光分析 1、不干扰，当单组分处理2、有干扰，可选择不同激发波长测定,四、定量分析方法的选择,1、直接测定法 通过测定被分析物的荧光强度来确定其浓度。 2、间接测定法 （1）通过化学反应使无荧光物质转变为适合测定的荧光物质； （2）通过荧光熄灭法测定荧光熄灭剂的浓度。 如过渡金属离子与具有荧光性质的芳香族配位体络合后，可使配位体荧光熄灭，从而间接测定金属离子。,（一） 单组分的荧光测定,1、当混合物中各个组分的荧光峰不重叠，彼此干扰很小时，可分别性质在不同的发射波长测定各个组分的荧光强度。 2、当混合物中各个组分的荧光峰彼
21、此重叠时，若其激发光谱有显著的差别，这时可选择不同的激发波长进行测定。,（二）多组分混合物的荧光分析,3、在选择激发波长和发射波长后仍无法分别测定混合物中的各组分时，可尝试同步荧光测定、导数荧光测定等方法。,（二）多组分混合物的荧光分析,1、原理 该法利用衍生的方法将自身不发荧光的分析物，转变为发荧光的化合物，通过测定该化合物的荧光强度间接测定分析物。 2、分类 可分为化学衍生法、电化学衍生法、光化学衍生法。,五、荧光衍生法,3、衍生化试剂需满足以下条件： （1）能在缓和条件下与被测物质快速定量反应； （2）生成的荧光衍生物应有良好稳定性； （3）若需经过色谱过程进行分离，则色谱分离后衍生化试
22、剂本身应无荧光。,五、荧光衍生法,4、常用衍生化试剂 （1）荧光胺 能与脂肪族或芳香族伯胺类形成高度荧光衍生物。 荧光胺及其水解物不显荧光。 荧光条件：ex=275、390nm， em =480nm。,五、荧光衍生法,（2）丹磺酰氯5-(二甲氨基)萘-1-磺酰氯 用于测定胺、蛋白质、多肽N-端氨基酸。 可与脂肪族或芳香族伯胺类反应生成磺胺，产生蓝色或蓝绿色荧光。 可与肽的N-端氨基酸反应，生成丹磺酰-肽，水解得到有强烈荧光的丹磺酰-氨基酸，用于蛋白质测序和氨基酸测序。 荧光条件：ex=350nm， em =500nm。,五、荧光衍生法,第四节 荧光分析法的应用,一、定性分析 二、定量分析 三、
23、应用与示例,一、定性分析,荧光激发光谱和荧光光谱可作为定性分析的手段，用以鉴定化合物。 根据试样图谱、荧光峰波长，与标准品进行比较。,一、定性分析,荧光激发光谱和荧光光谱可作为定性分析的手段，用以鉴定化合物。 根据试样图谱、荧光峰波长，与标准品进行比较。,二、定量分析,1、标准曲线法 常采用标准溶液系列中的某一溶液作为基准，先将空白溶液的荧光强度调至0，再将该标准溶液的荧光强度调至100或50，然后测定系列标准溶液的荧光强度，绘制标准曲线，计算回归方程。 再在同样条件下测定试样的荧光强度，利用回归方程求出试样的含量。,二、定量分析,为使不同时间绘制的标准曲线前后一致，每次绘制标准曲线时，均可采
24、用统一标准物质进行校正。 如果试样溶液在紫外光照射下不稳定，则须改用另一种性质稳定，而且荧光峰形和试样溶液近似的对照品溶液作为基准。,二、定量分析,如测定维生素B1时，采用硫酸奎宁的0.05mol/L H2SO4溶液作为基准（校正仪器）。 黄绿色荧光（维生素B2）可用荧光素钠的水溶液为基准。 红色荧光可用罗丹明B水溶液为基准。,二、定量分析,2、比例法 如果标准曲线过零点，可用比例法测定。 配制一标准溶液，使其浓度在线性范围内，测定荧光强度Fs，然后在同样条件下测定试样溶液的荧光强度Fx。由标准溶液的浓度Cs按下式可求得试样中荧光物质的浓度Cx或含量。若空白溶液的荧光强度调不到0，则Fs及Fx
25、值要扣除空白溶液的荧光强度F0后，按下式计算。对照品和样品溶液的浓度要尽可能接近，以减小误差。,（一）无机化合物的荧光分析 （二）合成药物的荧光分析 （三）中药的荧光分析,三、应用与示例,1、直接荧光测定法 待测元素与有机溶剂组成能发荧光的配合物，通过检测配合物的荧光强度以测定该元素的含量。 常用该法进行测定的元素有铍、铝、硼、镓、硒、镁、锌、镉及某些稀土元素。,（一）无机化合物的荧光分析,2、荧光熄灭测定法 某些元素虽然不与有机试剂形成发荧光的配合物，但是它会与发荧光的配合物争夺配位体，组成不发荧光的配合，使其产生荧光熄灭，由荧光熄灭的的含强度测定此该元素量。 如F、S、Fe、Ag、Co、N
26、i、Cu、Mo、W等的测定。,（一）无机化合物的荧光分析,3、间接荧光法 某些阴离子能从某些不发荧光的金属有机配合物中争夺金属离子，而释放出能发荧光的配位体，从而测定阴离子的含量。,（一）无机化合物的荧光分析,4、催化荧光法 某些反应的产物可产生荧光，但反应速度很慢，荧光微弱，难以测定。 若在金属离子的催化作用下，反应可加速进行，利用这种催化动力学的性质，可以测定金属离子的含量，这种方法称为催化荧光法。 可用于测定铜、铍、铁、钴、锇、银、金、锌、铅、钛、钒、锰、过氧化氢、氰离子。,（一）无机化合物的荧光分析,例4-1 利血平片含量测定,（二）合成药物的荧光分析,1、真伪鉴别 如川牛膝显淡绿黄色
27、荧光，其伪品红牛膝显红棕色荧光。 大黄新鲜切面显棕色荧光，其伪品河套大黄、华北大黄、藏边大黄和天山大黄皆显紫色荧光。,（三）中药的荧光分析,将药物浸出液点于层析滤纸或薄层色谱板上，用特定展开剂展开后，置荧光灯下观察。 如大黄和土大黄的鉴别可将样品用甲醇溶解，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10711)为展开剂展开。取出晾干，置紫外灯下检视，即可作出鉴别。,（三）中药的荧光分析,2、荧光检测 例4-2 HPLC-FLD法测定大鼠灌喂泻心汤后血浆中蒽醌类成分含量,（三）中药的荧光分析,1、分子荧光是如何产生的？荧光与磷光的产生机制有何区别？ 2、为何荧光发射光谱的形状通常与
28、激发波长无关？ 3、具有强荧光的物质通常具备哪些主要结构特点？ 4、影响荧光波长和强度的因素有哪些？ 5、指明下列几组化合物的荧光强弱顺序，并简要说明原因： （1）苯、萘、蒽； （2）酚酞、荧光素、四碘荧光素； （3）苯胺、苯、苯甲酸 6、维生素B2片研细混匀后，精密称取0.3012g的维生素B2片样品粉末，置1000ml容量瓶中，用1%醋酸溶解并稀释至刻度。滤过。精密吸取续滤液2ml，置50ml容量瓶中，以1%醋酸溶解并稀释至刻度。该溶液与浓度为0.728g/ml的维生素B2标准溶液测得的荧光强度分别为0.65和0.59，计算试样中维生素B2的质量分数（mg/g）。,复习思考题,Thank You!,
