1、酶解反应与膜分离耦合连续制备酪蛋白磷酸肽,Page 2,主要内容,引言,材料与方法,理论分析,结果与讨论,结论,Page 3,引言,酪蛋白磷酸肽,酪蛋白磷酸肽( CPPs) 是以乳酪蛋白为原料经酶解、分离、纯化而制得的含有成簇磷酸丝氨酸残基的活性多肽, 它具有多种特殊的生理功效, 尤其是促进Ca、Fe等元素高效吸收的功能使其具有“矿物质载体”的美誉。,酶解反应-膜分离耦合技术,酶解反应-膜分离耦合技术是集酶促水解、催化剂回收再用、产物分离纯化、苦味肽脱除等多步工序于一体, 是实现连续操作的有效模式。,Page 4,引言,本文是将连续流动搅拌釜式-超滤膜（CSTR/UF）组合酶膜反应器应用于活性
2、多肽的高效制备过程,考察操作变量对反应器性能和酶解反应转化率的影响规律；利用高效凝胶排阻色谱系统测定酶解物系相对分子质量分布；比较间歇与连续水解反应过程特性；并建立连续酶解反应动力学模型,为生物反应器的进一步工业放大提供理论基础。,Page 5,1.材料与方法,1.材 料：酪蛋白 胰蛋白酶甲醇其他试剂（均为分析纯） 2.实验仪器：自动电位滴定仪 双光束紫外分光光度计 HPSEC系统：WDL-95色谱工作站, P200II型高压恒流泵,UV-200II紫外可变波长检测器,排阻色谱柱 中空纤维超滤膜,Page 6,1.材料与方法,3.方法 连续酶解步骤与检测在图1所示装置中进行连续酶解反应,维持体
3、积、温度、pH、搅拌速率恒定,定时对截留液和渗流液取样检测。蛋白质含量测定采用标准蛋白紫外分光光度法；蛋白酶活性测定为F.I.P紫外分光光度法。 酶解产物色谱分析过程将连续酶解工艺所得截留液与渗流液，用0.45m微孔滤膜过滤后,按如下HPSEC操作条件进行色谱分析：流动相为0.1mol/L，pH=7磷酸缓冲液；流速0.5mL/min；进样量20L；检测波长280nm；检测时间45min；柱温25。 停留时间分布函数实验测定循环体系先以磷酸缓冲液做补液,待渗透通量稳定后,将补液迅速切换为已制得的多肽水解液(经6000Da中空纤维膜过滤),并连续检测280nm下渗流液的吸光度值变化。,Page 7
4、,1.材料与方法,Page 8,2.理论分析,动力学模型推导如下：对连续酶解反应过程做如下简化与假设:近似认为超滤膜组件对胰蛋白酶及酪蛋白完全截留；酶解前经底物循环保护后可忽略膜组件对该酶的活性影响；酶解单元遵循单底物拟均相不可逆酶促反应动力学方程；酶解操作达稳态时因体积 V反应器V中空纤维膜，渗透通量J循环J渗流，故可认为CSTR/UF的动力学行为近似等效于CSTR；暂不考虑物质在膜上的传质行为。,Page 9,上式中,so为初始底物质量浓度，g/L；eo为初始酶质量浓度,g/L；r为酶解反应速率,mol/(L)min)；Km为米氏常数,g/L；kcat为酶转换数；X为酶解反应转化率；为修正
5、空时。,2.理论分析,Page 10,3.结果与讨论,3.1 膜选择性研究,图2(a)表明,渗流侧的残存酶活无论有无底物循环始终很低(95%)；而渗流侧蛋白质质量浓度较低,说明酪蛋白很难透过超滤膜而近于完全截留,故有利于反应分离耦合连续水解工艺的实现。以上2项实验结果与模型推导中所作假设(1)和(2)一致。,Page 11,3.结果与讨论,3.2 操作变量对反应转化率X及反应器生产能力K的影响规律X及K值可有效表征反应器的性能特点,是衡量连续水解工艺的重要参数。结果如图3和图4所示。,Page 12,将so、eo、V、J4个参数归并为酶与底物质量浓度比(eo/so)以及平均停留时间t(V/J)
6、二组合变量来描述反应器性能。图3中X随eo/so的增大以乘幂规律平缓上升,而K则大幅降低,连续酶解时,增加底物质量浓度可在一定范围内最大限度地利用蛋白酶,但底物转化率相对减小,而增加酶质量浓度将使同样数量的底物降解更彻底,转化率更高,但单位酶产量相对减少;图4中V、J二参数对X及K值作用相反,影响规律与t值密切相关,V增大或J减小都将使t增大,这意味着酶与底物有充分的混合接触时间而使X以指数规律提高,而K值定义式决定的反应器生产能力则随t增大而减小。,Page 13,3.结果与讨论,3.3酶解物高效凝胶排阻色谱柱分析及膜截留率计算,Page 14,3.结果与讨论,对各谱峰面积积分并修正计算后求
7、得中空纤维膜对相对分子质量6000Da的原始底物与大肽有着较好的截留效果,同时酶解过程中不断形成的小肽也被及时排离,这既实现了反应与分离过程的集成,还可有效控制产物相对分子质量分布,为活性多肽的高效制备提供了一种很好的生产工艺模式。,Page 15,3.结果与讨论,3.4 BSTR间歇水解与CSTR/UF连续水解比较 3.4.1动力学常数由间歇及连续酶解反应L-B算图求得动力学常数列于表1。可见连续酶解过程Km值减小,kcat值增大,rmax值增大,说明底物酪蛋白与胰蛋白酶表观亲和力增强,酶促水解反应转换数增大,即单位时间内,胰蛋白酶活性中心能转化底物分子为产物的数目增多,酶解效率提高。 3.
8、4.2反应转化率及反应器生产能力与间歇反应器相比,酶膜反应分离耦合装置可明显消除产物抑制现象,在一定程度上解决间歇操作中转化率不高的问题(X值增加1.2倍),并使反应器生产能力K值提高35倍,见表1。,表-1,Page 16,3.结果与讨论,3.4.3酶解反应产量酶解产量Y是在考虑酶用量因素下表征水解效率的一项重要指标, 它相对于K值(稳态时产量)能更好地描述反应全过程中产物生成情况。图6表明:(1)随反应体积更迭次数(Jt/V)的增加,Y连续近于线性提高,但当体积变更3次(约12h)后,Y连续增幅变缓,这与酶失活、膜污染等因素造成的操作稳定性下降有关;(2)与间歇水解相比,因蛋白酶利用率提高
9、,使得连续水解产量大幅增加,表现为Y连续/Y间歇随酶循环使用次数的增加而近于正比提高。,Page 17,3.结果与讨论,3.5 CSTR/UF组合酶膜反应器中胰蛋白酶连续水解酪蛋白动力学建模 3.5.1停留时间分布函数验证图7为升阶示踪应答法检测得到的停留时间分布函数。可见,CSTR/UF反应器F(t)函数的实验测定值与理想全混流反应器CSTR 的理论分布函数F(t)=1-e-t/(V/J)相吻合,可认为二者具有相同的操作方程,这与模型推导中所做假设(4)一致。,Page 18,3.结果与讨论,3.5.2 动力学模型拟合验证代入X与修正空时之间的函数关系式(1)得到模型拟合曲线,见图8,理论计
10、算值与实验测定值之间的平均相对误差为10.63%,这可能是因为在简化建模时未考虑酶解反应的膜上行为所致。此外,忽略反应过程中因剪切或生热所造成的酶蛋白失活而引入的正误差是造成增大时,拟合值整体偏高的主要原因。,Page 19,4.结论,酶膜反应器中连续酶解反应具有以下特点:6000Da中空纤维膜件对酪蛋白及胰蛋白酶近于完全截留,进行底物循环保护有利于酶活性的保持;so、eo、V、J4项操作变量对K及X值均成反比关系;稳态时渗流液及截留液均以小肽为主,且渗流液主要谱峰与CPPs活性组分吻合,可有效控制产物相对分子质量分布;CSTR/UF反应器动力学行为近似等效于CSTR,所建动力学模型,可有效估算不同操作条件下的反应转化率X;连续水解过程较之间歇酶解反应Km减小,kcat增大,X、K、Y连续/Y间歇大幅提高。上述特点证明酶膜反应分离耦合技术具有强化反应过程、消除产物抑制、调控产物组成、提高酶解转化率与蛋白酶利用率, 并使产物多肽得到富集纯化等诸多优点,是连续高效制备CPPs的一种新模式。,
