1、生物药物的制备技术第一节 蛋白质类药物的工业生产一、材料的选取来源：动植物组织、微生物等。选取原则：富含蛋白质、容易获得和提取、无害二、蛋白质的提取胞外蛋白质 溶媒提取胞内蛋白质 破碎细胞 溶媒提取超声波、匀浆器等三、蛋白质的分离纯化最常用方法常用 NaCl、硫酸铵等盐析法加入不同浓度的中性盐进行蛋白质的分级沉淀。蛋白质一般不变性。有机溶剂沉淀法常用乙醇、丙酮易引起蛋白质变性，宜低温进行操作。可用于混合蛋白质的分级沉淀。等电点沉淀法选择在 pI不变性的蛋白质常联合其它方法使用。根据溶解度分离根据分子大小和形状分离半透膜常用玻璃纸等透析法加入不同浓度的中性盐进行蛋白质的分级沉淀。大分子不可透过半
2、透膜。超滤法超滤膜不同孔径膜易引起蛋白质变性，宜低温进行操作。大分子截留小分子滤过。凝胶过滤法分子筛凝胶葡聚糖凝胶等常联合其它方法使用。大分子受阻小，小分子受阻大。DialysisDialysis透析法凝胶过滤法Gel-Filtration ChromatographyGel-Filtration Chromatography根据电离性质分离蛋白质所带电荷种类、数量及分子大小差异电泳法蛋白质分离和分析的常用方法。 醋酸纤维素薄膜电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳等。离子交换层析法不同蛋白质与离子交换剂结合力大小不同可通过改变溶液pH和盐离子强度分离蛋白质。离子交换纤维素、离子交换凝胶、大孔
3、离子交换树脂等。聚丙烯酰胺凝胶电泳 （ PAGE）PolyacrylamideGel Electrophoresis等电聚焦电泳IsoelectricFocusingIsoelectricFocusing离子交换层析法Ion-Exchange Chromatography根据配基特异性分离 亲和层析法： 根据生物分子间亲和吸附和解离的原理而建立的层析法。Affinity Chromatography原理： 不溶性载体特异配基目的蛋白质，其他蛋白被洗脱掉其它常用分离方法密度梯度离心法Zonal Density Gradient Centrifugation四、蛋白质的分析鉴定Folin-酚试剂法
4、凯氏定氮法 双缩脲法 紫外分光 光度法蛋白质含量测定蛋白质的纯度鉴定方法：层析法、电泳法、免疫化学法、结晶法、等电聚焦法、溶解度分析法等等。常用方法：凝胶层析法、高效液相层析法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法。五、蛋白质类药物的制备示例 白蛋白人血浆络合 Na2CO3调 pH8.6依沙吖啶，静置分离 络合物解离 H2O， HCl调 pH弱酸性NaCl， 65 ，离心解离液浓缩超滤浓缩液热处理 60,10h 热处理液除菌 除菌过滤 白蛋白制备途径：制备途径：从生物材料中提取微生物发酵化学合成一、提取制备大分子 DNA的提取制备大分子 RNA的提取制备核苷酸的提取制备核苷的提取制备DNPDNA+ 蛋白质苯酚
5、法酸水解、碱 水解 、酶 水解浓氨水等剧烈条件二、其它制备方法天然结构物质类似物 /聚合物微生物发酵 /生物材料提取化学酶合成法肌苷、鸟苷酸等阿糖胞苷、氟尿嘧啶等超速离心法三、核酸的分离纯化凝胶电泳法柱层析法琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳排阻过滤层析： 葡聚糖凝胶 /聚丙烯酰胺凝胶分离 RNA；琼脂糖凝胶分离 DNA离子交换层析： DEAE-纤维素其它：反相层析等_+Agarose mesh凝胶电泳法四、核酸的含量测定方法定磷法 定糖法紫外分光光度法方法A260nm 0.022（ 1g/ml RNA）A260nm 0.020（ 1g/ml DNA）（加热条件下）D-核糖浓盐酸地衣酚绿色（
6、670nm）D-2-脱氧核糖酸二苯胺蓝色（ 595nm）有机磷消化 钼蓝660nmRNA:8.59.0%DNA:9.2%第三节 酶类药物的工业生产酶在临床上用于疾病治疗已有悠久的历史。由于酶是生理、生化过程的重要参与者，酶量的多少和活性的高低，直接关系到人的健康水平。因此，用酶治疗疾病有着十分广阔的前景。l酶类药物获取途径有两种：动植物和微生物直接提取微生物发酵生产l酶的制备一般包括四个基本步骤：预处理提取纯化结晶或制剂（一）生物材料的预处理 胞内酶要通过破碎细胞把酶释放，再进行抽提 酶类提取采用的常用细胞破碎方法有：机械法：利用捣碎机、研磨器或匀浆器等将细胞破碎 物理法：利用温度差、压力差或超声波等将细胞破碎化学法：指利用盐、碱、表面活性剂、甲醛、丙酮等有机溶剂作用于细胞 膜，使细胞膜的结构遭到破坏或透性 发生改变 酶解法：指选用合适的酶，使细胞壁遭到破坏，进而在低渗溶液中将原生质体破碎冻融法：反复冷冻与融化交替使细胞破碎空气干燥法干燥法 真空干燥法冷冻干燥法
