1、不同样品核酸提取、扩增、荧光定量PCR完美解决方案,北京百泰克生物技术有限公司（北京市海淀区上地信息路15号）,Fax：010-62951781 Tel：010-62951781 62983458 62979408,http:/ E-mail: ,不同样品核酸提取、扩增、荧光定量PCR完美解决方案,-核酸提取攻略,北京百泰克生物技术有限公司（北京市海淀区上地信息路15号）,不同样品RNA提取最适方法 RNA纯度与质量考察 RNA提取常见问题及解决方案 常见样品DNA提取 特殊样品DNA提取 DNA分离纯化中常见问题分析,内容概要,样品,裂解液,上层溶液,液氮研磨 或其他方法处理,抽提,细胞裂解
2、,干燥溶解 或洗脱,离心洗涤,酒精沉淀 或介质吸附,RNA提取流程,沉淀法：异丙醇或乙醇 介质吸附法：,RNA提取常用方法-沉淀方法,异硫氰酸胍/苯酚法 在变性剂异硫氰酸胍的作用下，细胞被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放； 释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离； 有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净RNA。,RNA提取常用方法-裂解方式,胍盐 /-巯基乙醇 盐酸胍裂解样本 ，抑制 RNase 的活性 ； -巯基乙醇变性蛋白,BioTeke的RNA提取试剂具有明显的优势,在经典试剂的基础上，不断升级。 多款高品质的RNA提取试剂：
3、Tri pure （Trizol） RNApure（Trizol法的升级产品）,组织/细胞样品RNA提取,材料：小鼠肝脏组织,方法：BioTeke RNApure高纯总RNA快速提取试剂盒0.1g样品组织 结果：,图：小鼠肝脏组织RNA,1 2 3 4,RNApure 高纯总RNA快速提取试剂,1 2 3,图片说明： 1 BioTeke RNAclean 2 BioTeke TRIpure (TRIzol法) 3 BioTeke RNApure 离心柱型 (注：本图实验材料为植物叶片）,同一样品基因组DNA和RNA分提,原理： 根据基因组DNA和RNA在硅基质膜上的结合条件不同，用两根离心吸附
4、柱分别提取基因组DNA和RNA。,特殊样品RNA提取-血液,图1全血样品溶解在TRI pure LS Reagent试剂后的状态,图2泳道1与2，在-80度保存一个月后的提取结果。M泳道：标准的Hela细胞RNA,材料：松针、冬青、香蕉、木菠萝和杨树,方法：通用植物总RNA提取试剂盒 （离心柱型）0.1g样品组织 结果：得率：约35-40g纯度：OD260/OD2801.82-1.95,1 2 3 4 5 6 7 8 9 10,图片说明：1、2 杨树；3、4 香蕉；5、6 松针；7、8 冬青；9 、10 木菠萝,多糖多酚植物样品RNA的提取,1 2 3 4 5 6 7 8 9 10,试剂盒适用
5、范围：水稻种子、小麦种子、玉米种子、高粱种子、拟南芥种子、大豆种子、苹果、葡萄、香蕉、棉花、龙眼、荔枝、各种草坪牧草植物、各种树木、各种花卉等绝大多数植物,图片说明：1、2DNA和大RNA；3、4Micro RNA (材料为小鼠肝脏组织),Micro RNA提取,1 2 3 4,提取原理： 传统方法：先提取总RNA然后跑胶回收或沉淀Micro RNA。 新方法：通过裂解液裂解和酸酚分层后过柱两次，一次去除基因组DNA和大片段RNA，后一次吸附Micro RNA，然后漂洗收集。,新方法特点： 高效分离小RNA，同时分离总RNA 可用于miRNA、siRNA和snRNA的分析 适用各种来源的样品
6、提取时间短，约30分钟完成实验,生物大分子具有共轭双键，在260和280nm波长处有光吸收峰。纯度：紫外分光光度计测定所提总RNA在260nm和280nm波长处的光吸收，以A260/A280的比值来判断总RNA的纯度。质量：甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定。,RNA纯度与质量考察,RNA提取常见问题及解决方案,RNA 的降解 OD260 /OD280 比值偏低 电泳带型异常 下游实验效果不佳,RNA的降解,新鲜细胞或组织： 裂解液的质量 外源RNase的污染 裂解液的用量不足 组织裂解不充分 另外某些富含内源酶的样品 (如脾脏，胸腺等)，很难避免 RNA 的降解。 建议在液氮条件下将组织碾碎，并且匀
7、浆时使用更多裂解液。,RNA的降解,冷冻样品： 样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后可以移至-70冰箱保存。样品要相对小一点； 先用液氮研磨，再加裂解液匀浆； 样品与裂解液充分接触前避免融化，研磨用具必须预冷，研磨过程中及时补充液氮。,RNA的保护,采集样品的保护： 通常用液氮保存 样品保护剂RNAfixer,样品浸泡其中可以在37保存一天，25一周，4一个月，-20一年左右。,环境中RNase的清除： DEPC处理各种实验器具 RNAsafe对溶液中RNase进行清除。 RNA酶喷雾清除剂，可对固体表面的RNase起到清除的作用，更大程度上避免RNase的污染。,蛋白质污染： 不要吸入中间层
8、及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。 减少起始样品量，确保裂解完全、彻底 解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。 苯酚残留： 不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。 解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。,OD260 /OD280 比值偏低,OD260 /OD280 比值偏低,抽提试剂残留： 确保洗涤时要彻底悬浮 RNA，并且彻底去掉 75% 乙醇。 解决办法:再沉淀一次后，溶解。设备限制：测定OD260 及OD280 数值时，要使OD260 读数在 0.10 - 0.50 之间。此范围线性最好。用水稀释样品：测 OD 时，对
9、照及样品稀释液请使用 10 mM Tris，pH 7.5。用水作为稀释液将导致比值的降低。,非变性电泳：上样量超过 3g，电压超过 6V/cm，电泳缓冲液陈旧，均可能导致 28S 和 18S 条带分不开。变性电泳条带变淡：EB 与单链的结合能力要差一些，故同样的上样量，变性电泳比非变性电泳要淡一些； 甲醛的质量不高 。,电泳条带异常,抽提试剂的残留 75% 乙醇洗涤 样品中杂质的残留 多糖等杂质，再次沉淀 DNA 污染 使用RNase-Free 的 DNase I 消化抽提RNA,下游实验效果不佳（RNA降解）,不同样品基因组DNA提取,常见样品基因组DNA提取 细胞/组织/细菌/血液基因DN
10、A提取 植物材料DNA提取 特殊样品基因组DNA提取 大量血液样品DNA提取 环境微生物DNA提取 临床样本DNA提取 DNA分离纯化中的常见问题分析,基因组DNA提取流程,化学方法 CTAB法：适用于植物材料等。是一种阳离子去污剂，溶解细胞膜，与核酸结合。在高盐下溶解释放DNA。 SDS法：适用于血液，细胞，动物组织，细菌，酵母等 物理方法机械剪切，超声波破碎，研磨匀浆等。易造成DNA断裂。 酶法 蛋白酶KBioTeke基因组DNA提取系列试剂盒综合利用上述方法,基因组DNA提取流程-细胞裂解,特点： 不需要使用有毒的氯仿、苯酚等试剂 多次柱漂洗确保高纯度；长度可达30-50Kb,提取原理：
11、,组织/细胞/细菌/血液基因组DNA提取,玉米叶片基因组DNA提取 （使用新型快速植物基因组DNA提取试剂盒）,提取原理：,植物材料基因组DNA提取,特殊样品基因组DNA提取,传统方法适用于所有材料基因组DNA的提取？比如大量血液？比如土壤/粪便中的微生物基因组DNA的提取？比如病毒及其他微量样品DNA的提取？NO！,中量/大量血液基因组DNA提取,传统方法消化后，用酚/氯仿抽提，时间长，损害操作人员健康 BioTeke创新不用蛋白酶消化不用酚/氯仿抽提 结果：得率：约75-250g /5mL血样纯度：OD260/OD2801.87-1.95,5ml全血基因组DNA提取电泳结果,土壤/粪便微生
12、物基因组DNA提取,其他品牌试剂盒存在缺点： 采用玻璃珠或钢珠破碎，导致基因组断裂严重； 必须购买破碎专用设备，增加使用成本； 采用包括玻璃奶、离心吸附柱串联的纯化方式，导致DNA大量损失，得率很低，很难真实反映土壤微生物的多样性。 BioTeke的技术创新： 采用酶法破碎，保证基因组的完整性； 用异丙醇沉淀DNA，DNA无损失。,临床样品基因组DNA提取,病毒基因组DNA提取 酵母基因组DNA提取 口腔拭子DNA提取 微量样品DNA提取 石蜡组织DNA提取 头发DNA提取,一步法DNA提取扩增,原理： 综合微量样品基因组DNA提取和高效的PCR扩增试剂。从毛发、石蜡组织等微量组织中高效提取足
13、够浓度的DNA，然后进行PCR扩增。操作简单、方便，可对大量样品同时进行操作。,保证基因组DNA的完整性和纯度提高DNA的洗脱效率DNA的储存,基因组DNA分离纯化中的注意事项,保证基因组DNA的完整性和纯度提高DNA的洗脱效率DNA的储存,基因组DNA分离纯化中的注意事项,简化操作步骤，缩短操作时间 减少物理因素对DNA的降解，震荡、搅拌等 减少化学物质对DNA的降解，操作多在pH4-10 防止基因组DNA的生物降解：DNase,保证基因组DNA的完整性和纯度提高DNA的洗脱效率DNA的储存,基因组DNA分离纯化中的注意事项,洗脱液65度预热10分钟 洗脱体积不小于30L 洗脱2次或者3次,
14、保证基因组DNA的完整性和纯度提高DNA的洗脱效率DNA的储存,基因组DNA分离纯化中的注意事项,可长期储存于pH=7.0的ddH2O或TE 不易制成干品储存 分装低温保存,如何提高微量核酸提取或回收后的浓度,核酸助沉剂的应用 微量吸附柱的应用-15l洗脱体系 质粒提取 胶回收或PCR产物回收 微量细胞/组织DNA/RNA提取 病毒DNA/RNA提取 微量临床样本DNA/RNA提取,不同样品核酸提取、扩增、荧光定量PCR完美解决方案,-Real-time qPCR攻略,北京百泰克生物技术有限公司（北京市海淀区上地信息路15号）,RT-PCR原理 Real-time qPCR原理及应用 Real
15、-time qPCR成功关键 Real-time qPCR数据分析 Real-time qPCR常见问题及解决方案,主要内容,中心法则与RT、PCR,RNA,DNA,RT,PCR,逆转录反应可以以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物（GSP）起始。 提取RNA的质量会影响到RT的产量及cDNA的完整性。 整个过程要求无RNA酶操作。 反转录酶、RNA酶抑制剂都会对产物的质量造成一定的影响。,反转录相关因素,Super M-MLV反转录酶 高效的逆转录活性，且无RNaseH活性Thermo M-MLV反转录酶 高效的逆转录活性，且无RNaseH活性 适合合成长片段的cDNA,有很强的模
16、板兼容性，对高GC含量（75%以上）和结构复杂的模板效果显著 在42-60具有较好的热稳定性。,One step RT-PCR,模板： 使用BioTeke公司的RNApure 总RNA提取试剂盒提取的鸡肝脏组织RNA,目的片段：管家基因-Actin 反应体系：反应程序：,RT-PCR相关产品,Super M-MLV反转录酶，10000u/198元 Super RT Kit cDNA 第一链合成试剂盒50次，特价490元 Super One-step RT-PCR Kit 一步法RT-PCR试剂盒50次，特价880元Thermo 系列产品买二赠一！ Thermo M-MLV反转录酶，10000u
17、/580元 Thermo RT Kit cDNA 第一链合成试剂盒50次，价格1200元 Thermo One-step RT-PCR Kit 一步法RT-PCR试剂盒50次，价格1400元,反转录酶及试剂盒系列产品讲座期间特价优惠！,RT-PCR原理 Real-time qPCR原理及应用 Real-time qPCR成功关键 Real-time qPCR数据分析 Real-time qPCR常见问题及解决方案,实时荧光定量PCR技术的应用,基因表达差异分析 拷贝数分析 SNP检测 miRNA定量 转基因成分定量分析 临床诊断、疾病及药物研发等,Real-time qPCR原理,如何对初始模
18、板定量 荧光信号如何产生？,Real-Time qPCR主要概念,Real-Time qPCR曲线的意义,扩增曲线,熔解曲线,图片为：首都医科大学演示实验结果 材料：小鼠肝脏 基因：-actin,实时荧光定量 PCR 的化学原理包括探针类和非探针类两种。 非探针类则是利用荧光染料（如SYBR Green I）或者特殊设计的引物(如LUX Primers)来指示扩增的增加。 探针类(TaqMan探针和 分子信标)是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加。 后者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但前者则简便易行。,荧光染料和荧光探针,SYBR Green I 工作原理,SYBR Gre
19、en I是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料，与双链DNA结合后，其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。SYBR GreenI的最大吸收波长约为497nm ，发射波长最大约为520nm。在PCR反应体系中，加入过量 SYBR 荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的 SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。,LUX (light upon extention) 引物是利用荧光标记的引物实现定量的一项新技术。目标特异的引物对中的一个引物 3 端用荧光报告基团标记。在没有单链模板的情况下，
20、该引物自身配对，形成发夹结构，使荧光淬灭。在有目标片断的时候，引物与模板配对，发夹结构打开，产生特异的荧光信号。,LUX 引物工作原理,TaqMan探针工作原理,F,Primer,Primer,Degradation of TaqMan probe by DNA polymerase,Reporter,Quencher,Suppression of fluorescence,分子信标（molecular beacon）工作原理,分子信标：一种在靶DNA不存在时形成茎环结构的双标记寡核苷酸探针。在此发夹结构中，位于分子一端的荧光基团与分子另一端的淬灭基团紧紧靠近。分子信标的茎环结构中，环一般为1
21、5-30个核苷酸长，并与目标序列互补；茎一般5-7个核苷酸长，并相互配对形成茎的结构。荧光基团连接在茎臂的一端，而淬灭剂则连接于另一端。分子信标必须非常仔细的设计，以致于在复性温度下，模板不存在时形成茎环结构，模板存在时则与模板配对。与模板配对后，分子信标的构象改变使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发时，它发出自身波长的光子（图5）。,荧光阈值(Threshold),Ct,Ct值是扩增DNA的量达到阈值时候的循环次数。,Ct 值与起始模板的关系研究表明，每个模板的 Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多， Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横
22、坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表 Ct 值（如图所示）。因此，只要获得未知样品的 Ct 值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。,Ct值,Real-time qPCR流程,一步法和两步法优缺点比较,根据自己需求，选择合适的方法！,RT-PCR原理 Real-time qPCR原理及应用 Real-time qPCR成功关键 Real-time qPCR数据分析 Real-time qPCR常见问题及解决方案,Real-time qPCR成功因素,引物设计：3末端尽量不是A；1824bp；扩增产物80-150bp;设计在基因保守区内Taqman探针：尽量靠在上游引物；长度3045bp，
23、Tm比引物高至少5；5端不要是G，G会有淬灭作用，影响定量 RNA质量和定量比较好，2条主带可见（28s和18s）；定量准确 内标（housekeeping gene）正确选择18s rRNA, -actin, GAPDH等 标准曲线的准确制作R20.99,反应体系：模板浓度不要太高，反转录最多1g总RNA，PCR一般1L反转录产物；引物浓度一般100nM-1mM；根据kit要摸索最佳反应条件小心操作：每管或每孔都要换新枪头！不要连续用同一个枪头加样，即使是混 合液！每个样品至少要做3个平行孔。每组实验最好有3个重复，做统计 分析。,Real-time qPCR成功因素,做real-time
24、qRT-PCR前，做个普通的PCR，检测您的反应条件！,RT-PCR原理 Real-time qPCR原理及应用 Real-time qPCR成功关键 Real-time qPCR数据分析 Real-time qPCR常见问题及解决方案,Real-time qPCR数据分析,基线（baseline） 通常是315个循环的荧光信号 同一次反应中针对不同的基因需单独设置基线 阈值（threshold) 自动设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍 手动设置：置于指数扩增期，刚好可以清楚地看到荧光信号明显增强。 同一次反应中针对不同的基因可单独设置阈值， 但对于同一个基因扩增一定要用同一个阈
25、值。 Ct值 :与起始浓度的对数成线性关系 分析定量时候一般取Ct:15-35.太大或者太小都会导致定量的不准确。,统计分析方法,绝对定量： 此方法是用一系列已知浓度的标准品制作标准曲线，在相同的条件下目的基因测得的荧光信号量同标准曲线进行比较，从而得到目的基因的量。该标准品可以是纯化的质粒DNA，体外转录的RNA，或者是体外合成的ssDNA。 相对定量： 通过与内参基因Ct值之间的相差来计算基因表达差异,一般是 2-Ct 。或者是考虑扩增效率的Pfaffl法。,绝对定量,相对定量,Marisa L. Wong and Juan F. Medrano: BioTechniques July 2
26、005,相对定量,实时检测（在对数扩增时期）而不是终点检测 敏感性高 需要样品少 特异性高（Taqman） 精确定量,Real-time qRT-PCR优点,RT-PCR原理 Real-time qPCR原理及应用 Real-time qPCR成功关键 Real-time qPCR数据分析 Real-time qPCR常见问题及解决方案,特异性 重复性 灵敏度 其他问题,常见问题讨论,扩增的特异性,引物？,Tm，重新设计引物，优化条件,Tm,重复性-判断实验优劣的重要指标,判断指标：主要为标准差（SD）和变异系数（CV）影响重复性的因素： PCR 反应扩增的效率：优化实验条件，使反应体系达到最
27、佳扩增效率 。 目的基因的初始浓度： 使用初始浓度具有较高数量级的样本或作平行孔。 标准曲线的影响：不少于5个稀释度的标准品，涵盖待测样本中目的基因量可能出现的全部浓度范围；理想的标准品应与样本具有高同源性，质粒DNA 或是体外合成、转录的RNA。,影响灵敏度的因素,反应体系中形成的引物二聚体的影响 可以用水解探针代替SYBR Green I，有文献报导使用水解探针的敏感性要比SYBR Green I高出10倍。 可以使用热启动办法或使用特殊处理的Taq酶 要尽可能地优化引物设计 如果反应体系中出现PCR的抑制因素，应适当将目的基因的浓度稀释后再进行扩增。 注意避免室温混合各种试剂，并且在一经
28、混合后立即开始进行扩增。 循环数 Mg2的浓度,Q1:无Ct值（信号）出现,可能性不大,检测荧光信号的步骤有误: 一般SG法采用72延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。 引物或探针降解: 可通过PAGE电泳检测其完整性。 模板量不足: 对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。 模板降解: 避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。,Q2:Ct值出现过晚（Ct38）,扩增效率低: 反应条件不够优化。设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。 PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。 PCR产物太长: 一般采用80-150bp
29、的产物长度。,Q3:标准曲线的线性关系不佳,加样存在误差: 使得标准品不呈梯度。 标准品出现降解: 应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。 引物或探针不佳: 重新设计更好的引物和探针 模板中存在抑制物，或模板浓度过高。,Q4:阴性对照也出现明显的起飞,反应mix或水被污染。 引物二聚体的出现： 用SG法在35cycles以后阴性出现起飞属正常情况，可配合熔解曲线进行分析。 反应过程中探针的降解：用PAGE电泳对探针进行检测。 ROX校正的问题：如果使用了，则可能是ROX的降解所造成。,Q5:熔解曲线不止一个主峰,引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。 引物浓度不佳：适当降
30、低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。 镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒。 模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。,Q6:扩增效率低,反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。 反应条件不够优化：可适当降低退火温度或改为三步扩增法。 反应体系中有PCR反应抑制物：一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响。,Q7:同样的试剂在不同仪器上产生不同的曲 线，如何比较？,判断标准：扩增效率，灵敏度，特异性,BioTeke产品从根本上解决您的实验问题,荧光定量PCR试剂盒系列产品讲座期
31、间特价优惠！ 2SYBR real-time PCR premixture 荧光定量PCR试剂盒200次，特价890元 2SYBR real-time RT-PCR premixture反转录荧光定量PCR试剂盒50次，特价1090元 One-step SYBR real-time RT-PCR Kit一步法荧光定量试剂盒50次，特价1200元,BioTeke Real-time qPCR产品可用于各种仪器,ABI: PRISM 7000/7700/7900HT,7300/7500Bio-Rad: DNA Engine Option/DNA Engine Option2/Chromo4 Rea
32、l time System,iCycler IQ/MyiQ/iQ5Stratagene:Mx3000P/Mx3005PRoche: Light cyclerBioer: Line-Gene其他各种real- time qPCR扩增仪,ROX参考染料：在荧光检测中标准化非PCR相关的震荡；在qPCR中提供一个稳定的基线,BioTeke Real-time qPCR产品反应程序,两步扩增反应 Real-time qPCR:,三步扩增反应 Real-time qPCR:,溶解程序：（dissociation program),扩增反应完成后的最后一步，检测扩增反应的特异性。不同仪器要求的程序稍微不同。,ABI7000的溶解程序：,BioTeke Real-time qPCR产品反应程序,BioTeke产品应用实例-最权威的声音来源于实践,目前应用最广泛的主流仪器：ABI系列及Bio-Rad系列。来自Bio-Rad系列的检验报告。来自ABI系列的检验报告。我们都做得很好，我们一直在不断创新，力求解决您的实验需求。,不同公司荧光定量试剂比较,百泰克让您的实验更完美,选择BioTeke，选择信任与回馈,Fax：010-62951781 Tel：010-62951781 62983458 62979408,http:/ E-mail: ,谢谢大家！,MSN: QQ: 78001304,
