1、受精的机制,内容提要,第一节 成熟精子和卵子的结构第二节 卵母细胞成熟的分子机理第三节 精子入卵的调控第四节 精子和卵子的接触和识别第五节 卵子代谢的激活第六节 遗传物质的融合,受精胚胎发育的启动,受精（fertilization）指的是精子和卵子各自的单倍体基因组相融合形成两倍体合子的事件。受精的第一个功能是将父母的基因传递给子代，第二个功能在卵细胞质中激发一些确保发育正常进展的系列反应。 受精过程随动物物种而异，但一般都包含以下几个主要方面：卵母细胞成熟，精子获能，精卵间的接触和识别（包括向化性的距离效应），精子入卵（配子融合的遗传物质的融合），卵的激活并开始发育。整个过程实为激素调控下的
2、联级反应。,1. 成熟精子和卵子的结构2. 卵母细胞成熟的分子机理3. 精子入卵的调控4. 卵子代谢的激活5. 遗传物质的融合,精子的发现1678年，荷兰显微镜专家Anton van Leeuwenhoek发现了精子，Nicolas Hartsoeker（ the other co-discoverer of sperm）描绘了一幅精子中存在一个预成的小人 (a preformed human homunculus)的画面。,第一节、成熟精子和卵子的结构,17世纪末，意大利的博物学家Lazzaro Spallanzani 发现过滤去除精子之后的精液不能使蟾蜍的卵子受精（filtered toa
3、d semen devoid of sperm would not fertilize eggs）。,In 1824, J. L. Prevost and J. B. Dumas （French speaking）发现只有性成熟的雄性动物才能产生精子，而未成熟的和年老的动物体内都没有精子产生，同时他们还注意到骡的不育性。,精子头部由顶体囊泡（acrosomal vesicle）和精核构成。大部分精子的细胞质在精子成熟过程中被排除。顶体位于精核前端，由高尔基体演化而来。顶体中含有多种水解酶，主要作用是溶解卵子的外膜。有些动物的顶体中还有与精卵识别有关的分子。整个精核是一致密结构，几乎看不到染色质
4、丝和核仁，精子中所有的基因都不表达。,人类精子由头部、中部（颈部）和尾部组成。,精子的结构,精子的运动装置鞭毛的超微结构，示微管排列的“92”结构。,A. 精子的成熟过程B、C分别为牛和小鼠的精子。,卵子的结构 成熟卵子中合成和吸收了大量的物质，包括大量的蛋白质、核糖体和tRNA、mRNA、形态发生因子（morphogenetic factor）以及保护性化学物质（如Ig），为以后的生长和发育奠定了基础。,海胆卵子的结构，示精子和卵子的大小比例。,卵质外是质膜（plasma membrane），质膜外是卵黄膜（vitelline envelope）。质膜在受精时可以调控特定的离子在卵子内外的流
5、动，且能与精子质膜融合。卵黄膜能识别同一物种的精子，对受精的物种特异性有非常重要的作用。在哺乳动物中特称为透明带（zona pellucida），紧靠着透明带的一层滤泡细胞称为放射冠（corona radiata）。,仓鼠卵子受精前的卵子被包裹在透明带（zona pellucida）内，透明带的外围为卵丘细胞（cumulus cell）层所包围。,皮层（cortex）是质膜下一层约5um厚的胶状胞质，比内部的胞质硬，含有高浓度的肌动蛋白分子，受精时，聚合成微丝，延伸到细胞表面形成微绒毛（microvilli），帮助精子进入卵子。皮层内有皮层颗粒（cortical granule），含消化酶、粘
6、多糖、黏性糖蛋白和透明蛋白，阻止多精入卵并可以为卵裂球提供支持。,第二节 卵母细胞成熟的分子机理,动物的卵细胞长期停顿于第一次减数分裂的双线期。在适当的信号刺激下可以恢复减数分裂，直至第二次减数分裂中期，成为等待受精的成熟卵。,1.1 卵母细胞成熟的分子机理,卵母细胞趋于成熟的形态学标志为：核膜破裂（又称生发泡破裂，germinal vesicle breakdown, GVBD），染色体凝集，纺缍体形成和第一极体排出。 一般认为，PP39mos具恢复卵减数分裂并使之停顿在第二次减数分裂的作用，但是，必须与cdk2激酶共同作用才能实现。故推测所谓的细胞静止因子（cytostatic facto
7、r, CSF）实由PP39mos和cdk2组成。CSF保护cyclin B不被降介。 在卵母细胞质贮存着母型c-mos mRNA，经外源信号刺激，母型c-mos mRNA加Poly（A）尾，由此翻译出相对分子量为3.9104的磷蛋白PP39mos。该蛋白只在成熟过程中出现，受精后迅速降介。,第二次减数分裂完成的原因,cdc25CyclinB+P34cdc2 MPF前体 MPF 受精，Ca+1（激活）细胞进入M期 CK （CSF维持） （依赖钙调蛋白的酶蛋白激酶）PP39mos,cdc2CSF（解体）cyclinB（降介）第二极体排出，细胞进入G1期（雌、雄原核融合，受精结束） 图2.1,第三节
8、 精子入卵的调控,3.1 精子获能 是指射出的精子在生殖道获能因子作用下，精子膜发生一系列变化（如吸附于精子膜表面精液蛋白的去除，膜表面蛋白的重组等），进而产生生化和运动方式的改变。获能后，精子穿越卵母细胞周围的滤泡细胞和透明带的能力提高，这是精子发生顶体反应的前奏。 在获能反应中，研究最透彻的激酶有cAMP和PKA，磷脂激活的蛋白激酶（PKC）和酪酸激酶。,哺乳动物精子的获能，牛精子在到达输卵管壶腹部之前与输卵管上皮细胞的接触。,哺乳动物精子获能的模型,3.2 顶体反应,精子头部与卵子膜成分接触诱发顶体反应（acrosomal reaction） 一般来说，只有同种精子可以与卵膜上物种特异性
9、受体识别，从而与膜细胞建立密切的接触。 在哺乳动物中，卵子透明带上精子结合蛋白，尤其是ZP3，不仅检查精子种类，而且触发了顶体反应。,海胆的精卵识别是由特异性结合蛋白（Bindin）所介导的。Bindin定位在精子的顶体突起上，具有种属特异性。卵子卵黄膜上存在Bindin的受体，也被分离纯化出来。,海胆卵子表面的Bindin受体,3.3 阻断多精进入机制受精的专一性与唯一性,当精卵细胞膜融合时，其它精子的进入应被阻止。受精生物学有两种不同的阻断多精进入（polysperiny）的机制： 一种是通过使卵子精子结合受体失活，从而阻止更多精子的粘附，这称为初级、快速阻断多精进入机制。 另一种是通过所
10、谓受精膜（fertilization membrane）的迅速膨胀来实现的次级、永久阻断多精进入机制。 在卵子激活时，两种阻断机制均被启动。,膜融合后，精子的内部成分它的细胞核、线粒体和中心粒进入卵子中。然后，遗传分析表明只有母体线粒体存活。因此，线粒体基因只在雌性谱系中遗传。母本线粒体遗传的唯一性已激起全体遗传学家们在创立线粒体种系发育学。,哺乳动物的精卵识别哺乳动物精卵的特异性识别发生在卵细胞的透明带（zona pellucida）部分。 小鼠 透明带中含有ZP3 糖蛋白 ，它与ZP1、ZP2以网状的骨架结构存在于透明带中。 ZP3能结合精子，并引发顶体反应。,精子细胞膜上有三种受体：1.
11、 sp56（56kDa，半乳糖结合蛋白）-可与ZP3分子上的半 乳糖端部相结合。如果ZP3的一个半乳糖基发生丢失或改变，精子将无法与卵子结合。2. 半乳糖基转移酶 (GalTase)可与ZP3分子上的N-乙酰葡糖胺结合 ，使精子G蛋白激活并诱导顶体反应。3. P95 （ZP受体激酶）(95kDa)一种跨膜蛋白，其外侧部分可与ZP3分子特异结合，而内侧部分具有酪氨酸激酶的功能。该酶被激活后，导致顶体反应。,ZP3在小鼠精子与透明带的结合中的作用。,3.4 雌雄配子的融合,精子通过与卵黄膜或透明带的相互作用，发生顶体反应，使和精子结合的卵黄膜或透明带被顶体反应释放的水解酶溶解，并在该位置进行精卵细
12、胞膜的融合。雌雄配子的融合大多被限定在特定的区域内。,海胆双精受精卵（dispermic egg）第一次卵裂的中期。,人类双精受精卵的第一次有丝分裂。,3.5 快速阻碍多精入卵 卵膜中存在离子通道，卵膜的快速阻碍多精入卵作用是通过改变自身膜电位形成的。精子进入卵细胞触发细胞膜静息电位迅速去极化，引起膜外精子与卵细胞识别和融合的障碍。 如人为维持原有的膜电位，可诱导多精受精现象发生；如改变正常的初始膜电位， 则会阻止卵细胞的受精。,海胆卵受精前后的膜电位变化,3.6. 皮层颗粒反应 多精受精快速阻碍机制中膜电位的变化时间非常短暂（1 min左右），不足以永久实现阻碍多精入卵。 结合到卵黄膜的精子
13、是通过皮层的小泡破裂，发生皮层反应被移除的；否则将导致多精入卵。,皮层由皮层颗粒组成，通常分布在没有微绒毛结构的卵膜下方。当精子进入卵子时，皮层颗粒与卵膜发生融合，颗粒内容物被释放到卵膜和卵黄膜之间的区域卵黄周隙（perivitelline space），这些释放物中有几种蛋白质在皮层颗粒反应中发挥了重要的作用。,海胆皮层颗粒反应示意图,皮质颗粒内含物中含有的蛋白质：1）. 蛋白水解酶可以使卵黄膜与质膜间的联系分离；剪除卵膜上bindin的受体及与之结合的精子。2）. 粘多糖：进入卵周隙吸水膨胀，使卵黄层向外隆起，形成受精膜（fertilization envelope ）举起。,3）. 过氧
14、化物酶：皮层颗粒分泌的过氧化物酶通过交联相邻蛋白质的酪氨酸残基使受精膜变硬。 受精膜最先在精子入卵的位置形成，并向外扩张至整个卵细胞，从而阻止多精入卵。4）. 透明质素（hyalin）：在卵外形成透明质层(hyalin layer)，它与卵裂中对分裂球的支持作用有关。卵细胞质膜突起的微绒毛深入到其基部。,第四节 卵子的激活,顶体微丝与卵黄膜的接触触发了一连串戏剧性事件：1精卵细胞膜在接触处融合，通过由精子注入到卵子的一种激活因子建立了一条通道。接着，精子的细胞核、中心粒和线粒体通过这条通道直接进入卵子中。2卵膜电性的去极化（depolarization）。到达晚的精子不能与改变了电压的卵子受体
15、建立联系。3在精子接触点上，磷脂酰肌醇（PI）信号通路被启动。,4第二信使IP3和环腺甘二磷酸一核糖（cyclic ADP-ribose）或精子提供的激活因子，导致钙离子从内质网中释放到胞浆中。5钙波引起皮质小泡（cortical vesicles）也称皮质颗粒（cortical, granules）大量胞吐。 皮层颗粒的爆发不仅产生游离的、膨胀的凝胶状物质而促使受精膜（fertilization membrane or envelope）形成，而且也释放破坏透明带上精子结合蛋白的酶类。以上任何一种情况都能使膨胀的卵黄膜丧失精子结合能力。,6PKC（蛋白激酸C）被DAG激活后，通过刺激Na+/
16、H+泵反向转运，使胞浆中pH升高。 目前假说认为离子交换和pH升高创造了使储存的RNP（ribonucleoprotein,核糖核蛋白）颗粒中的 mRNA释放和转译的条件，新生成的蛋白质中有多种组蛋白，它是卵裂过程中染色体复制所必需的物质。,7另一连串事件发生以激活PKC开始，最后导致DNA复制。 受精 PKCDNA复制启动新生蛋白质P1P2 DAG pH RNP释放 mRNA转译 IP3 Ca2+cyclinB降介CSF卵子排 出第二极体 受精卵的代谢启动,海胆卵受精时释放的钙波从精子入卵点开始跨越整个卵,卵子激活的可能机制2,受精后利用卵细胞质中储存的mRNA迅速合成大量的蛋白质,第五节、
17、遗传物质的融合5。1 雌雄原核的形成及融合单倍体的精子核进入卵细胞后，解凝聚形成雄原核（male pronucleus），卵细胞核则形成雌原核（female pronucleus）。精核形成雄性原核的过程受到卵子的严格控制。精子入卵时线粒体与鞭毛在卵细胞内降解，因此线粒体基因一般认为是母源性的；但中心体是父源性的。,海胆雌雄原核的融合 海胆雄原核形成后旋转180，其中心体位于雌、雄原核之间，装配成星体，连接并牵动雄原核与雌原核相互靠近，最后融合形成合子核（zygote nucleus）。,海胆雌雄原核的迁移,中心体发出的微管形成星光，连接并牵动雄原核与雌原核相互靠近,人类受精过程中雌雄原核的运
18、动,5.2. 哺乳动物雌雄原核的不均等性 形成合子的雌雄原核所携带的单倍体基因组并不等同。一个尚未被了解的生物学进程选择性地沉默父本或母本来源的等位基因，即印记。目前已有60多个哺乳动物的印记基因得到克隆，这些基因在发育过程中起着重要的作用。 粪蝇父本的基因组是沉默的，仅表达来自母本的基因。,Imprinting 基因: 在卵子发生或精子发生过程中被打上了不同印记的基因。 由于印记不同，来源于雌核和雄核基因的表达模式也不同，即在胚胎发育过程中，有些基因仅来自于雄性的表达，而另一些基因仅来自于雌性的表达。因此只有来自于精子和卵子的二倍体才能正常发育，而仅来自于雌核或雄核的二倍体胚胎则要在发育过程
19、中夭亡。,正常对照（左）和两个雌原核发育成的胚胎（右）,雌核胚的发育,将小鼠受精卵的雄原核移除，移入1个雌原核，组成具有两个雌原核的雌核胚(Gynogenetic embryo)。雌核胚体外培养，88%发育为桑椹胚和囊胚时期。移植至受体后，其发育程度与孤雌胚相似，而且总是极少滋养层。雌核胚和孤雌胚均因没有雄性基因组不能发育至出生，其主要原因是由于缺乏胎盘组织所致。因为至妊娠中期小鼠胎儿的生长依赖于通过胎盘获得营养，不能得到充分的营养胎儿停止发育而死亡。,雄核胚的发育,将受精卵的雌原核移除，移入另1雄原核组成具有两个雄原核的雄核胚(Androgenetic embryo)。经培养仅20%雄核胚发
20、育至囊胚期。缺少X染色体时形成YY遗传结构的雄核胚，仅能卵裂数次即停止发育。雄性基因组不能有效地促进胚胎发育至囊胚期。很少雄核胚能着床发育，极少数着床后发育至68体节期，但具有发育良好的滋养层组织。以孤雌胚和雄核胚细胞聚合而成的嵌合胎儿检测两类细胞的分布结果：雄核胚细胞仅位于卵黄囊和滋养层，孤雌胚细胞则在胚体和卵黄囊，滋养层中无孤雌胚细胞。上述研究结果表明，雌性基因组主要形成胚体，而雄性基因组主要形成胚外膜。,5.3. 细胞质成分在受精后的的重组 卵细胞受精后引起卵细胞成分的重新排比和分配称为卵细胞质重排，这种重排对于以后发育过程中细胞的分化至关重要。 在卵裂过程中，胞质中含有的形态形成决定子被分配到特定的细胞中去，最终导致特定的基因被激活，从而使不同的细胞获得不同的特性。,背囊动物Styela partite减数分裂中，核破裂释放出一种清亮物质，集中在动物极。受精5min后，清亮层与黄色皮质层(含脂肪)向植物极迁移。随着雄原核向赤道方向迁移，脂包涵体和清亮物质也随之迁移。清亮和黄色胞质的最终位置将分别形成间充质和中胚层。,两栖类的灰色新月 精子入卵后，皮层向精子进入的方向旋转大约30，在动物极皮层含大量色素而内层含有少量色素的物种中，这一胞质不同层次的相对运动形成了一个在精子进入点对面的新月形的灰色区域，称为灰色新月。,
