1、第十二章 分子荧光分析法 Molecular fluorescence Analysis 主讲：姬晓灵,内容： 1. 概述 Introduction 2 . 基本原理 Basic Principle 3 .溶液的荧光强度Fluorescence intensity in solutions 4 .分子荧光分析仪器 Molecular fluorescence spectrometers 5 . 应用 Applications,教学目标和要求,1.了解荧光和磷光 2.掌握 荧光分析法的基本原理：荧光的产生、定性、定量方法 3. 掌握影响 F 因素：分子结构、外因（温度、溶剂、酸度、表面活性剂、荧
2、光熄灭剂、散射光和激发光等。 4.了解荧光分析仪器的结构及类型：荧光光度计和荧光分光光度计，学会分析操作技术。,荧光从入射光的垂直方向，即在黑背景下检测荧光,1 概述 Introduction,1575年，西班牙的内科医生和植物学家N.Monardes在含有木头切片的水溶液中第一次发现了极为可爱的天兰色荧光； 1852年，Stokes在考察奎宁和绿色素的荧光时，提出荧光是光发射的概念，并研究了荧光强度与荧光物质浓度的关系，描述了荧光猝灭现象，成为第一个提出用荧光作为分析手段的人； 1867年，Goppelsrode应用铝-桑色素配位化合物的荧光测定铝，成为历史上第一个进行荧光分析工作的人。,一
3、、荧光与磷光 光致发光现象能量提供方式 ： 光照、加热、化学反应、生物代谢等,二、荧光分析法（fluorescence analysis） 定义： 利用物质的荧光谱线位置及其强度，对物质进行定性和定量分析的方法。 定性鉴别：由于不同的物质其组成与结构不同，所吸收光的波长和发射光的波长也不同 。 定量分析：如果该物质的浓度不同，它所发射的荧光强度就不同。,三、荧光分析法特点灵敏度高、选择性好、样品用量少 、操作简便。,四、荧光分析法分类 1、根据发光物质分类分子荧光原子荧光 2、根据激发光的波长范围分类紫外-可见荧光红外荧光X射线荧光,2 基本原理 Basic Principle,一、分子荧光,
4、（一）分子荧光的产生 1、分子能级与激发态分子中能级：电子能级、振动能级、 转动能级。 电子能级状态： 单重态 三重态 区别： 电子自旋方向不同；能级能量不同,2、荧光的产生,1. 振动驰豫Vibrational relexation 分子通过碰撞以热的形式损失部分能量，从较高振动能级下降到该电子能级的最低振动能级上。,2. 内转换 Internal conversion 激发态分子将多余的能量转变为热能，从较高电子能级降至较低的电子能级。,3. 荧光 fluorescence 分子回到第一电子激发单重态的最低振动能级后，仍不稳定，停留较短时间后（约10-8 s，称作荧光寿命），以光辐射（荧光
5、）形式放出能量，回到基态各振动能级 。,4. 系间窜跃 Intersystem crossing 有些物质的激发态分子通过振动驰豫和内转换下降到第一电子激发态的最低振动能级后，有可能经过另一个无辐射跃迁转移至激发三重态。,5. 磷光phosphorescence 分子在激发三重态的最低振动能级，停留一段时间（10-410 s，称作磷光寿命），然后以光辐射（磷光）形式放出能量返回到基态各振动能级，。,6、外部能量转换 External conversion,（二）荧光的激发光谱和荧光光谱 （1）. 激发光谱 excitation spectrum激发光谱表示不同激发波长的辐射引起物质发射某一波长
6、荧光的相对效率。 绘制激发光谱： 保持荧光发射波长不变，依次改变激发光波长，测定不同波长的激发光激发下得到的荧光强度F，绘制F-激发曲线。,（2）. 荧光光谱 fluorescence spectrum 荧光光谱表示在所发射的荧光中各波长的相对强度。 绘制荧光光谱： 保持激发光波长不变，依次改变荧光发射波长，测定样品在不同荧光波长处发射的荧光强度F，绘制F- 发射 曲线。 （3）激发光谱和荧光光谱的作用定性鉴别荧光物质选择测定波长,（三）荧光光谱与激发光谱的关系,1. 荧光光谱形状与激发光波长无关 （斯托克斯位移） 2.荧光光谱波长比激发光波长长，荧光发射能量比激发光能量低。,3.镜像对称,解
7、释 ：能级结构相似性荧光光谱为第一电子激发单重态的最低振动能级跃迁到基态的各个振动能级而形成，即其形状与基态振动能级分布有关。激发光谱是由基态最低振动能级跃迁到第一电子激发单重态的各个振动能级而形成，即其形状与第一电子激发单重态的振动能级分布有关。由于激发态和基态的振动能级分布具有相似性，因而呈镜像对称。,二、荧光与分子结构 荧光物质的必要条件：有强的紫外吸收有较高的荧光效率 (一）荧光寿命和荧光效率（fluorescence efficiency） 荧光寿命：当除去激发光源后，分子的荧光强度降低到最大荧光强度的1/e所需时间。 荧光效率：,荧光素钠水=0.92 荧光素水=0.65 蒽 乙醇=
8、0.30 菲乙醇=0.10,（二）分子结构与荧光的关系1、长*共轭结构：大多数能产生荧光的物质都含有芳香环或杂环具有共轭的* 跃迁。其共轭程度愈大，荧光效率也愈大，波长长移。,分子的刚性和共平面性越大，越大，荧光强度越强。,1,=0.18,=0.92,(非荧光物质),2.分子的刚性,有些物质本身不发荧光或荧光较弱，但和金属离子形成配合物后，如果刚性和共平面性增加，就可以发荧光或增强荧光。如8-羟基喹啉是弱荧光物质，与Mg2+、Al3+ 等金属离子形成的配合物的荧光增强，利用这一特点可以间接测定金属离子。,3、取代基团对分子荧光的影响 给电子取代基：能增加分子的电子共轭程度，使荧光效率提高。如N
9、H2、OH、OCH3、CN、NHR、NR2等， 吸电子取代基：可减弱分子电子共轭性，使荧光减弱甚至熄灭。而-COOH、NO2、C=O、F、Cl等 还有一类取代基则对荧光的影响不明显，如R、SO3H、NH3 等。,苯环取代基 对荧光的影响,（三）荧光试剂（荧光条件） 1、荧光胺 2、邻苯二甲醛 3、1-二甲氨基-5-氯化磺酰萘 4、测定无机离子的荧光试剂（表12-1）,三、影响荧光强度的外部因素 1、温度 当温度升高时，介质粘度减小，分子运动加快，分子间碰撞几率增加，从而使分子无辐射跃迁增加，荧光效率降低。,2、溶剂（1）荧光强度在一定范围内可随溶剂黏度的减小而减小； （2）溶剂和荧光物质形成化
10、合物，改变物质的性质； （3）荧光波长随溶剂极性增大而长移。,3、表面活性剂 增溶、增敏、增稳作用。 优点： 1）增加荧光物质的溶解度； 2）增加摩尔吸光系数； 3）增加荧光物质的稳定性。,4、pH值,（1）溶液pH值改变，物质分子和其离子间的平衡也随之发生变化，而不同形体具有其各自特定的荧光光谱和荧光效率。 例如苯胺：,（2）溶液pH值的改变会影响配合物的组成，从而影响它们的荧光性质。Ga3+邻-二羟基偶氮苯pH341:1配合物（荧光）Ga3+邻-二羟基偶氮苯pH6712的配合物（无荧光）。,5、荧光熄灭定义：由于荧光物质分子间或与其它物质相互作用，引起荧光强度显著下降的现象叫做荧光熄灭或猝
11、灭。 荧光熄灭剂：卤素离子、重金属离子、氧分子、硝基 化合物、重氮化合物和羧基化合物等。,荧光熄灭机制： 激发态荧光分子和熄灭剂分子碰撞，将能 量转移到熄灭剂而使荧光熄灭； 荧光分子与熄灭剂分子作用生成了本身不发光的配合物； 荧光物质分子中引入重原子（溴或碘）后，易发生系间窜越而转变为三重态；,当荧光物质浓度较大时，激发态分子和基态分子发生碰撞。溶液浓度越高，自熄灭现象越严重； 溶液中溶解的氧分子能引起几乎所有的荧光物质产生不同程度的荧光熄灭。 荧光熄灭法： 利用荧光强度的减小与熄灭剂的浓度呈线性关系建立的 对荧光熄灭剂的定量分析法。 例如：铝-桑色素的配合物与熄灭剂氟浓度成反比,6、散射光（
12、scattering light） （1）. 瑞利散射光 光子和物质分子发生弹性碰撞，光子运动方向发生改变，其波长和激发光相同。 消除：选择适当的荧光测定波长或选用滤 光片即可消除其影响。,（2）. 拉曼散射光 光子和溶剂分子发生非弹性碰撞，使光子能量减小或者增加，光的波长增长或变短，这两种散射光均称为拉曼（散射）光。其中波长较长的拉曼光因其波长与物质的荧光波长相接近, 故对测定的干扰较大。 区别： 瑞利散射光波长与激发光波长相同； 拉曼光波长随激发光波长的改变而改变，长波拉曼光可干扰荧光测定；荧光波长与激发光波长无关。,散射光谱,散射光谱,第三节 荧光定量分析,一、荧光强度与溶液浓度的关系,
13、根据Beer定律,所以,由于溶液的荧光强度与溶液对光的吸收程度及荧光效率成正比，即,当abc0.05（即溶液很稀）时，,对于一定的荧光物质，当测定条件固定时，,二、定性分析,利用荧光物质的特征光谱（激发光谱和荧光光谱）鉴定物质。,三、定量分析,1. 标准曲线法 （高浓度溶液调节荧光强度约100%）,F,c,Fx,cx,2. 比例法（直接比较法）,3、联立方程式法,第四节 仪器,一、仪器的构造及原理,仪器 一般包括五部分： 激发光源、单色器1、单色器2、样品池、检测器,1. 光源： 溴钨灯 高压汞灯 氙灯 要求：发射紫外到可见区波长的光、强度大、稳定。,2. 单色器 两个单色器,3. 样品池 通
14、常用石英制成,4. 检测器 光电倍增管,二、仪器类型 1. 光电荧光计 光源：溴钨灯或高压汞灯 单色器：滤光片 （激发滤光片和荧光滤光片） 检测器：光电管 2. 荧光分光光度计 光源：氙灯 、 单色器：光栅（可连续扫描激发光谱和荧光光谱） 检测器：光电倍增管,三、荧光分析新技术简介 激光荧光分析 （激光光源：单色性好、光强度大） 时间分辨荧光分析 （利用物质的荧光寿命不同达到分别检测的目的） 同步荧光分析 （同时扫描激发光谱和发射光谱，得到同步荧光光谱，进行测定。灵敏度高） 胶束增敏荧光分析 （胶束溶液对荧光物质的增溶、增敏和增稳作用）,四、荧光分析法应用 （一）有机化合物的荧光分析 维生素、
15、氨基酸和蛋白质、胺类和甾族化合物、酶和辅酶以及各种药物、毒物和农药等，许多均能发射荧光，可以用荧光分析法进行测定或研究其结构或生理作用机制。 （二）无机化合物的荧光分析 利用待测元素与有机试剂组成的能发荧光的配合物进行荧光法分析的无机元素已近70种。,小 结 一、基本概念 荧光、振动驰豫、内部能量转换、外部能量转换、体系间跨越、磷光、激发光谱、发射光谱、瑞利散射光、拉曼散射光。 二、基本理论 荧光效率 荧光光谱的特征 有机化合物分子结构与荧光的关系 影响荧光强度的外部因素（温度、溶剂、酸度、散射光） 荧光定量分析法（校正曲线法、比例法、联立方程式法） 荧光分析仪器,光学分析法小结：UV-Vis
16、,AAS,MFA对比,方法 UV-Vis AAS MFA,光谱 特征 带状吸收光谱 锐线光谱 带状发射光谱A- K0- F-ex 激发光谱F-F 荧光光谱定性依据 - 定性依据,定量分析 A= b c A=KC F=k I0.2.3 abc (abc0.05) 单色光 锐线光源 强光源峰值吸收 稀溶液（A0.05),定量方法 标准曲线法 标准曲线法 标准曲线法 比较法，示差法 比较法 比较法解联立方程法等 标准加入法 解联立方程法,仪器 紫外可见分光光度计 原子吸收分光光度计 荧光光度计 （结构框图） 单波长，双波长 单光束，双光束 荧光分光光度计单光束，双光束 （垂直方向检测）,干扰 非单色光，光度误差 光谱干扰， 溶剂，温度.酸度 物理化学因素 物理、化学干扰， 散色光影响显色反应的因素 电离干扰，背景吸收 荧光熄灭剂。激发光,
