1、293T 细胞培养1.培养基: DMEM =丙酮酸钠+10%血清+青链霉素2.复苏：37 度融化后，擦干冻存管 酒精擦，细胞加入 15ml 离心管，加 5ml 培养基，500g 离心 5min，弃上清，加 1ml 培养基重悬后加入到培养瓶中，56ml 左右，记得晃匀。3. 传代 : 吸出旧培基，加 5mlPBS 洗一遍，用移液管加 1ml 胰酶，洗一遍吸出，37 度放 1min 左右计时，看到大片大片脱落了即加入新培基吹打，吹洗充分后，吸 1ml 加到事先加好10ml 新培育基的新瓶里。293T 细胞是用 5 型腺病毒 75 株系转化，含有 Ad5 E1 区的人胚肾亚三倍体细胞系，是一 种 E
2、1 区缺陷互补细胞系。293T 细胞是贴壁依赖型呈上皮样细胞，表现出典型的 腺病毒转化细胞的表型， 细胞允许 Ad5 和其他血清型腺病毒在其上增殖。 哺乳细胞的大规模培养方式有三种：贴壁培养、微载体培养、无血清悬浮培养。这三种方式均可用于 293T 细胞 的大规模培养。293T 细胞在无 Ca2+或含 Ca2+培养基中可同样生长，也可生长在血清浓度降低的培养基中。单层培养细胞在 5-10FBS-DMEM 中能生长很好。一般来讲，1:10 传代后， 一周可以长满。严禁过度生长，这点很重要。因为会导致细胞密度加大和堆积，影响病毒斑的形成和转染，传代时也不易打散。悬浮的 293T 细胞很容易大规模培
3、养，但不容易长期保持稳定。293T 细胞在传代 120 次以后，其表型可能改变，生长状况不再完全是单层的了，偶尔会形成局部的细胞成团聚集，应立即抛弃，重新引入新传代的细胞。 293 细胞培养特性： 1、 细胞明显适应酸性环境,pH 值在 6.97.1 时,可顺利贴壁生长, 换液 293T 时动作要轻。一般用高糖的 DMEM 培养基。 2、传代：倒去废液，PBS 洗一次（轻） ，用 0.02%EDTA 与 0.25%Trypsin 消 化，生长良好细胞，培养瓶中轻摇,使之流遍所有细胞表面,即将其吸除或弃去消化 30s，然 后吸去，再让剩下的 EDTA/Trypsin 作用 30s,镜下观察细胞脱
4、落,就可加 DMEM 终止消化，反 复吹打至细胞全成单个悬浮细胞即可。12 小时-24 小时 90%以上细胞贴壁。293 细胞传代时机为达 80-90%汇合，传代比例为 1：3。3、293 细胞在低代时容易贴壁，生长良好，在传到几十代以后，易聚集成团，且贴壁不牢，用 PBS 冲洗时即可能脱落，即使消化后也不容易吹打成单细胞悬液，最好购入时先大量冻存。 4、复苏 293 细胞的另一生长特性是贴壁所需时间长且贴壁不牢。细胞冷冻后复苏时,都有不同程度的肿胀,若以 50ml 培养瓶待细胞长满瓶底的 70%80%时消化冻存, 复苏时将其全部接种至 2 个 50ml 瓶中时较为合适。刚复苏的 293 贴壁
5、很慢，复苏接种后 24 小时内,应尽量减少观察细胞次数或不作观察,以免因晃动而影响细胞贴壁。复苏后 48 小时 左右观察贴壁情况并进行首次更换培养基比较合适, 如果用一次性塑料培养瓶可增加细胞贴 壁牢度。换液前宜将培养基预热。5、转染：体外应用 293 细胞进行细胞转染时，如果是采用磷酸钙转染，一定要注意 293 细胞不要全部长满细胞培养盘， 长满细胞时加入磷酸钙就会使 293 细胞大片的 脱落，最好是当 293 生长到 1/2 或 2/3 时进行磷酸钙转染，可以避免细胞的大量脱落。 其它的经验：1、用大瓶培养较小瓶要好，可能是更有利于 293 均匀的分布，利于营养的摄取 2、培养液要新鲜，每
6、次只配 1000ml，分为 2-4 瓶，不用的培养液，冻存在 -20 度，3、要及时传代，最好是细胞基本铺满培养瓶底部，但是细胞之间还没有完全 贴紧，总是多少有空隙的时候最好。 4、如果细胞贴壁不好，可能是消化过久，或是培养瓶不够干净，当然要除外 细胞污染。 细胞的复苏： 快速取出冻存的低代次 293 细胞，将其安放在底端 12 浸于 37水浴中，轻轻晃动以 加速融解。在超净工作台中，以 70 乙醇对细胞培养皿表面消毒，将细胞转移至 75 cm 的细胞培养瓶中，加入 10 mL 低代次 293 细胞培养基置于细胞培养箱内培养。68 h 后待细胞贴壁更换培养基。(1)利用低代次 293 细胞贴壁
7、的特性，在复苏和传代时不离心，而是加入 10 mL 培养基中和细胞消化液，培养 68 h，细胞贴壁后更换新鲜培养基，从而避免了离心剪切力对细胞造成的机械损伤；(2)在消化细胞时，振荡培养瓶，避免直接反复剧烈吹打细胞。细胞形态观察、贴壁率和生长曲线表明，这种方法对细胞损伤小，能维持细胞较好的生长状态。 NG 等研究表明，低代次 293 细胞在培养过程中传代时融合度过高或过低，其整合的腺病毒 El 区基 因易丢失；另外，不适当的传代比率也会导致细胞生物学特性发生改变。为此，笔者把细胞传代的融 合度控制在 90左右， 传代比率 l： 以腺病毒感染质粒 pFG140 感染传 l0 代以后的低代次 293 细胞， o 可成功包装出腺病毒，表明这种传代方法可较好保持细胞的生物学特性。
