转化紫花苜蓿的研究.doc

1、转 化 紫 花 苜 蓿 的 研 究摘 要 ： 在 已 建 立 的 紫 花 苜 蓿 Medicago sativa 体 细 胞 胚 高 频 再 生 体 系 的 基 础 上 ， 研究 了 侵染时间、负 压 处 理 、 预 培 养 及 共 培 养 时 间 、 脱 菌 及 选 择 方 法 等 因 子 对 转 化效 率 的 影 响 ， 并 初 步 获 得 了 抗 性 体 肚 。关 键 词 ： 紫 花 苜 蓿 ； 体 细 胞 胚 ； 根 癌 农 杆 菌 ； AziVHXl;遗 传 转 化土 壤 盐 碱 化 是 人 类 面 临 的 世 界 性 难 题 。 据不 完 全 统 计 ， 全 球 约 有 9. 5

2、X 10s hmz 盐 碱 地 ，分 布 于 100 多 个 国 家 ， 其 中 中 国 的 盐 渍 地 面 积约 为 9. 9 X107 hm2,并 有 逐 年 扩 大 的 趋 势通 过 生 物 技 术 培 育 耐 盐 作 物 品 种 是 改 良 利用 大 面 积 盐 荒 地 、 缓 解 我 国 现 有 人 口 对 土 地 压力 的 有 效 措 施 之 。 紫 花 巷 猜 Medicagu sativa素 有 “牧 草 之 王 ” 的 美 称 ， 具 有 丰 富 的 营 养 价 值和 广 泛 的 生 态 适 应 性 3。 研 究 表 明 ， 在 盐 碱 地上 种 植 紫 花 苜 蓿 可 以

3、显 着 改 善 盐 溃 土 的 理 化 性质 ， 降 低 土 壤 含 盐 量 1。 但 由 于 紫 花 苜 蓿 数 千年 来 生 长 在 低 盐 或 非 盐 渍 化 土 壤 中 ， 其 抗 盐 能力 较 弱 ， 属 于 中 等 抗 盐 作 物 ， 所 以 较 难 在 盐 碱地 上 种 植 。 Na+是 造 成 植 物 盐 害 的 主 要 离 子 之 一 。植 物 细 胞 抵 御 其 内 部 盐 胁 迫 的 主 要 方 式 是 将 细胞 内 过 多 的 Na+泵 人 液 泡 ， 这 一 过 程 是 由 液 泡膜 Na+/H+逆 向 转 运 蛋 白 （ AtNHXl)完 成 的 。 将抗 盐 基

4、因 AfNHXl 转 人 其 它 作 物 如 番 前 Lycopersicon esculentum5、 油 菜 Brassica napus6、 小 麦 Tritivum aestivum7 和 玉 米 Zea ma0yS8等 已 有 许 多 成 功 报 道 ， 而 且 抗 盐 基 因/UNHX1 的 表 达 确 实 能 够 明 显 提 高 上 .Advances in studies on genetic transformation of tall fescueWU Guan-ting, CHEN Jin-qing (Institute of Virology and Biotechno

5、logy Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021 China)Abstract ： Tall fescue (Festuca arundinacea ) is an important perennial coolseason grass species widely planted for forage and turf purposes in temperate regions throughout the world. For a long time，tall fescue has been improved

6、by traditional breeding. Advances in transgenic technology have provided an effective way for development of new cultivars of tall fescue. At present, studies to improve tolerances to adverse environments，resistances to diseases, pests and herbicides as well as quality traits of this grass species b

7、y genetic engineering are being carried out in a lot of companies and laboratories at home and abroad. In this paper，progresses in genetic transformation of tall fescue were reviewed in terms of recipient materials, transformation methods，target genes, influencing factors and transgene inheritance.K

8、ey words： Tall fescue; genetic engineering； recipient material； transformation method； transgene； inheritance述 农 作 物 的 耐 盐 性 。 然 而 ， 将 基 因 导 人 紫 花 苜 蓿 ， 从 而 获 得 适 合 在 盐 碱 地 种 植 的 紫花 苜 蓿 转 基 因 新 品 系 的 研 究 至 今 国 内 外 尚 未 见报 道 。 研 究 旨 在 建 立 根 癌 农 杆 菌 介 导 AdVf/Xl基 因 转 化 紫 花 苜 蓿 的 遗 传 转 化 体 系 ， 以 期 为 培育 出

9、 适 合 在 盐 碱 地 种 植 的 抗 盐 性 强 的 转 基 因 紫花 苜 蓿 新 品 系 奠 定 基 础 。1 材 料 和 方 法1.1 材 料 所 用 植 物 材 料 为 紫 花 苜 蓿 大 叶 、 陇 东 、陇 中 、 甘 农 1 号 和 甘 农 3 号 等 5 个 品 种 无 菌 苗 下 胚 轴 切 段 和 下 胚 轴 来 源 的 体 胚 。 所 用 根 癌 农杆 菌 菌 株 为 LBA4404,由 美 国 加 州 大 学 Blumwald 教 授 赠 送 ， 含 有 双 元 Ti 质 粒 载 体 pHZXl， 该 载体 含 有 NPT-n 筛 选 标 记 基 因 和 CaMV35

10、S 启 动 子调控 的 编 码 拟 南 芥 液 泡 Naf7H+逆 向 转 运 蛋 白 的 AtNHXl 基 因 ， 基 因 长 度 2 485 bp。 质 粒 pHZXl 结 构 如 图 1 所 示 。1.2 方 法1.2.1 抗 生 素 抑 菌 浓 度 的 确 定 用 无 菌 牙 签 挑 取农 杆 菌 白 色 单 菌 菌 落 ， 加 人 20 mL 含 有 不 同 浓 度 羧 苄 青 霉 素 （ Carb) (80、 100、 150、 200、 250、 300、 350、 400、 450、500 mg/L)的 I 上 液 体 培 养 基 中 ，置 摇 床 2S C,200 rpm，

11、暗 培 养 24 h。取 经 培 养 的 LB 液 体 培 养 基 2 mL， 用 紫 外 分 光 亮 度 计 测 定 菌 液 浓 度 OD_值 。 每 个 处 理 重 复 3 次 。 计 算 出 3 个 重 复 样 品 的 OD_值 的 算 术 平 均 值 。 以 未 加 菌 液 的 液 体 LB 为 空 白 ， 未 加 抗 生 素 但 加 有 农 杆 菌 的 液 体 LB 为 对 照 。盛 有 制 备 好 的 农 杆 菌 菌 液 （ ODw。 为 0.5 0_7)的 无 菌 三 角 瓶 中 ， 封 口 膜 封 口 。 然 后 置 于 真 空 干 燥 器 中 ，抽 真 空 1 min 后 ，

12、 迅 速 打 开 真 空 泵 气 阀 恢 复 常 压 ， 再关 闭 阀 门 抽 真 空 30 s (简 称 负 压 断 续 处 理 1 min/30 s)，共 设 7 个 处 理 ： 0、 2X 1 min/30 s、 4X1 min/30 s、 6Xl min/30 s、 7Xl min/30 s、 10X1 min/30 s、 13Xl min/30 s0 1.2.5 共 培 养 将 侵 染 过 的 外 植 体 用 无菌 滤 纸 吸 干 表 面 多 余 的 菌 液 ， 接 种 到 铺 有 无 菌 滤 纸 的 MSH 培 养 基 （ 含 200 fimol/L AS 或 不 含 ） 上 （p

13、H 值 5. 3 5. 6) ,24 C 暗 处 共 培 养 13 d。1.2. 6 脱 菌 及 抗 性 体 胚 的 筛 选 农 杆 菌 的 脱 菌 采 用2 种 方 式 ， 固 体 脱 菌 和 液 体 脱 菌 。 固 体 脱 菌 就 是 将共 培 养 后 的 外 植 体 直 接 转 移 到 固 体 脱 菌 培 养 基 MSH + 200 mg/L Carb 上 ，24 C，16 h/d 光 照I EcoRHind m pst 1:一 L-Oll LB/17NOS-pro NPTII NOS-ter CaMV 35S NOS-ter下 胚 轴 出 愈 率 陇 东 下 胚 轴 出 愈 率 大 叶

14、 体 胚 分化 率 陇 东 o -体 胚 分 化率 大 叶oooo0 50 100Kan 浓 度 (mg/10图 3 卡 那 霉 素 （ Kan)对 紫 花 苢 蓿 下 胚 轴 和 体 莊 的 影 响8642%)鲚伞培 养 3 周 ； 而 液 体 脱 菌 是 将 共 培 养 后 的 外 植 体 先 转 人 加 有 200 mg/L Carb 的 MSH 液 体 培 养 基 中 180 rpm 振 荡 洗 涤 3 d， 然 后 用 无 菌 滤 纸 吸 干 外 植 体上 的 液 滴 ， 再 转 移 到 固 体 脱 菌 培 养 基 MSH + 200 mg/L Carb 上 24 C 暗 培 养 2

15、 周 ， 然 后 24 C， 16 h/d 光 照 培 养 1 周 。在 对 抗 性 体 胚 进 行 选 择 时 ， 同 时 采 取 了 前 期 选 择 和 延 缓 选 择 2 种 方 法 。 前 期 选 择 就 是 共 培 养 后 ， 在 脱 菌 培 养 基 MSH + 200 mg/L Carb 中 同 时 加 人 50 mg/L Kan;延 缓 选 择 是 指 共 培 养 后 ， 先 在 MSH + 200 mg/L Carb 培 养 基 上 进 行 脱 菌 培 养 3 周 ，之 后 将 脱 菌 的 胚 性 愈 伤 转 人 SH + M mg/L Kan +100 mg/L Carb 上

16、 暗 培 养 10 d， 再 光 照 培 养 10d。 在后 续 继 代 中 去 掉 Carb， 直 到 有 成 熟 体 胚 形 成 （ 有不 定 芽 产 生 ） 。2 结 果 与 分 析2. 1 抗 生 素 抑 菌 浓 度 的 确 定 Carb 是 植 物 基 因工 程 中 经 常 使 用 的 一 种 脱 菌 抗 生 素 。 LBA4404 是 紫 花 苜 蓿 遗 传 转 化 中 使 用 最 多 的 一 种根 癌 农 杆 菌 C,arb 的 抑 菌 实 验 结 果 表 明 (图 2)， 该农 杆 菌 菌 株 LBA4404 对 Carb 特 别 敏 感 ， 在 Carb浓 度 为 100、

17、200 和 500 mg/L， ODwl,值 分 别 为 0. 019、 0.016 和 0.015， 且 在 Carb 浓 度 为 200500 mg/L 时 ， ()D6。 。 值 基 本 没 有 变 化 。 由 此 可 见 ， 200 mg/L 的 Carb 便 可 完 全 抑 制 农 杆 菌 LBA4404 的生 长 ， 这 与 Shao 等 D1发 现 的 LBA4404 对 Carb 较为 敏 感 的 结 果 相 一 致 。 所 以 ， 在 本 实 验 中 选 用 200 mg/L 的 Carb 作 为 LBA4404 的 脱 菌 浓 度 。0.2 0.0 -0 100 200 3

18、00 400 500Carb 浓 度 （ mg/L)图 2 羧 苄 青 霉 素 (Carb)对 农 杆 菌 LBA4404 生 长 的 影 响2. 2 选 择 培 养 基 中 Kan 选 择 压 的 确 定 不 同 的植 物 材 料 对 Kan 的 敏 感 性 或 抗 性 会 有 所 不从 图 3 可 以 看 出 ， 当 Kan 浓 度 为 50 mg/L 时 ，陇 东 苜 蓿 下 胚 轴 出 愈 率 为 5%， 大 叶 苜 蓿 下 胚 轴出 愈 率 为 7%。 而 当 Kan 浓 度 为 80 mg/丨 ： 时 ， 仍 不能 将 其 有 效 杀 死 。 只 有 Kan 浓 度 增 加 到 1

19、00 mg/L时 ， 陇 东 和 大 叶 苜 蓿 下 胚 轴 出 愈 率 才 都 降 为 0。由 此 可 知 ， Kan 对 紫 花 苜 蓿 下 胚 轴 的 最 佳 选 择 压为 100 mg/L。从 图 3 还 可 以 看 出 ， 与 下 胚 轴 相 比 ， 当 Kan 浓 度 为 40 mg/L 时 ， 陇 东 和 大 叶 苜 蓿 体 胚 分 化 率 均 已 降 至 2%;当 Kan 浓 度 在 50 mg/L 以 上 时 ， 陇东 和 大 叶 苜 蓿 体 胚 均 不 能 分 化 出 不 定 芽 ， 随 着 培养 时 间 的 延 长 ， 大 部 分 体 胚 停 止 发 育 并 褐 化 死

20、亡 。所 以 ， 对 紫 花 苜 蓿 体 胚 而 言 ， Kan 最 佳 浓 度 选 择为 50 mg/L。2. 3 对 转 化 效 率 的 影 响 在 研 究 中 发 现 ， 当 OD_低 于 0.5 时 ， 被 侵 染 的 下 胚 轴 和 体 胚 没 有 出 现 褐化 腐 烂 的 现 象 ， 但 也 没 有 得 到 抗 性 愈 伤 或 体 胚 。而 当 （ )D_大 于 0. 7 时 ， 在 筛 选 培 养 基 上 ， 下 胚轴 和 体 胚 均 出 现 了 大 量 褐 化 和 腐 烂 的 现 象 。 在（ )0_为 0. 5 0. 7 时 ， 侵 染 的 下 胚 轴 和 体 胚 基本 上

21、没 有 出 现 腐 烂 的 现 象 ， 在 筛 选 培 养 基同 。 所 以 ， 在 实 验 过 程 中 ， 根 据 植 物 材 料 的 不 同 ，筛 选 出 一 个 能 将 未 转 化 细 胞 杀 死 ， 而 又 能 使 转 化 细 胞 存 活 下 来 的 Kan 临 界 浓 度 至 关 重 要 。 研 究 也发 现 ， 不 同 的 紫 花 苜 蓿 品 种 和 外 植 体 类 型 ， 对 Kan 的 抗 性 也 有 所 不 同 （ 图 3)， 如 大 叶 苜 蓿 与 陇 东 苜 蓿 相 比 ， 无 论 下 胚 轴 还 是 体 胚 ， 对 Kan 的 抗 性 前 者 都 高 于 后 者 ； 同

22、 一 品 种 内 ， 下 胚 轴 对 Kan 的 抗 性 高 于 体 胚 。上 生 长 良 好 ， 且 比 较 容 易 形 成 抗 性 愈 伤 或 体 胚 。 所 以 ， 在 实 验 中 ， 将 0. 5 0. 7 作 为 农 杆 菌 侵染 的 最 适 浓 度 。2.4 负 压 处 理 及 农 杆 菌 侵 染 时 间 对 转 化 效 率的 影 响 随 着 对 大 叶 苜 蓿 下 胚 轴 和 体 胚 负 压 处 理及 农 杆 菌 侵 染 时 间 的 延 长 ， 抗 性 愈 伤 率 和 抗 性体 胚 转 化 率 都 呈 现 出 先 上 升 后 下 降 的 趋 势 （ 图 4)。当 负 压 处 理

23、及 农 杆 菌 侵 染 时 间 为 10 X 1 min/30 s 时 ， 下 胚 轴 抗 性 愈 伤 率 达 到 了 最 大 值 17%(图 4);当 负 压 处 理 及 农 杆 菌 侵 染 时 间 为 6X 1 min/30 s时 ， 抗 性 体 胚 转 化 率 达 到 了 最 大 值 31%。 另 外 ，研 究 中 发 现 ， 下 胚 轴 转 化 率 明 显 低 于 体 胚 转 化率 （ 图 4)， 因 此 ， 选 用 体 胚 作 为 后 继 转 化 工 作中 的 外 植 体 。下 胚 轴 和 体 胚 轴 转 化 率 的 彰 响根 癌 农 杆 菌 对 植 物 的 侵 染 过 程 是 受

24、到 植 物 伤 口 分 泌 的 酿 类 化 合 物 诱 导 ， 菌 体 先 吸 附 于 组 织 表 面 ， 然 后 将 Ti 质 粒 上 的 T-DNA 转 移 并 整 合 进 植 物 基 因 组 中 。 黎 茵 等 1213的 研 究 发 现 ， 适 当 的负 压 处 理 可 以 提 髙 根 癌 农 杆 菌 对 紫 花 苜 蓿 体 胚的 转 化 频 率 。 在 实 验 中 （ 图 4)也 发 现 了 类 似 现象 ， 负 压 处 理 使 得 下 胚 轴 和 体 胚 的 转 化 频 率 都得 到 了 一 定 程 度 的 提 高 。 这 很 可 能 是 由 于 采 用负 压 处 理 可 以 对

25、外 植 体 造 成 一 定 程 度 的 伤 害 ，使 菌 液 更 易 渗 人 组 织 内 部 ， 有 利 于 农 杆 菌 吸 附 ，从 而 提 高 转 化 频 率 。 但 负 压 处 理 时 间 不 宜 过 长 ，以 免 对 外 植 体 伤 害 过 大 而 影 响 生 长 。2. 5 共 培 养 时 间 对 转 化 效 果 的 影 响 在 24 C、 _为 0. 5 0. 7 条 件 下 ， 共 培 养 3 d 时 ,大 多数 外 植 体 周 围 都 出 现 肉 眼 可 见 的 菌 落 ， 此 时 将外 植 体 转 入 筛 选 培 养 基 具 有 较 高 的 再 生 频 率 。这 与 周 翼

26、明 14和 郝 贵 霞 等 15的 研 究 结 果 一 致 。另 外 ， 本 研 究 表 明 ， 在 共 培 养 基 上 铺 一 层 无 菌滤 纸 ， 可 以 防 止 外 植 体 周 围 农 杆 菌 的 过 度 繁 殖 。2.6 脱 菌 方 式 及 选 择 方 法 对 转 化 效 果 的 影 响从 表 1 可 知 ， 液 体 脱 菌 明 显 优 于 固 体 脱 菌 的 方式 ， 在 固 体 脱 菌 培 养 基 上 培 养 20 d 时 ， 污 染 率 为 36%;而 采 用 液 体 脱 菌 的 方 式 在 脱 菌 培 养 基 上 培 养 20 d,仍 没 有 出 现 体 胚 污 染 的 现 象

27、 ， 这 可 能是 因 为 ， 液 体 脱 菌 是 在 黑 暗 条 件 下 进 行 的 ， 这一 方 面 可 以 消 除 Carb 见 光 易 失 活 的 弊 端 ， 另一 方 面 ， 又 可 以 将 吸 附 在 外 植 体 上 多 余 的 农 杆菌 提 前 活 化 而 将 其 杀 死 。 所 以 ， 在 后 继 的 遗 传转 化 中 都 采 用 后 一 种 方 式 脱 菌 。匕 等 3的 研 究 表 明 ， 在 含 有 2， 4-D 的 培养 基 上 ， 高 浓 度 的 Carb 会 抑 制 紫 花 苜 蓿 体 胚的 分 化 和 植 株 的 再 生 。 所 以 ， 在 研 究 中 ， 当LB

28、A4404 在 脱 菌 过 程 中 被 有 效 抑 制 后 ， 将 体 胚 诱导 培 养 基 中 的 Carb 浓 度 降 为 100 mg/L， 并 在后 续 的 继 代 过 程 中 ， 将 其 去 掉 。 另 外 ， 由 于Carb 在 光 照 条 件 下 容 易 分 解 失 活 ， 所 以 在 脱 菌前 期 采 用 暗 培 养 的 方 法 ， 等 农 杆 菌 得 到 有 效 抑制 后 ， 再 进 行 光 照 培 养 。 这 些 措 施 都 有 效 地 改善 了 抗 性 体 胚 的 存 活 率 。从 表 2 可 知 ， 对 于 紫 花 苜 蓿 体 胚 的 选 择 ，前 期 选 择 的 方

29、法 抗 性 体 胚 转 化 率 仅 为 6%;而 采取 延 迟 选 择 的 方 法 ， 抗 性 体 胚 转 化 率 为 31%，与 前 者 相 比 ， 提 高 了 5 倍 多 。 结 果 充 分 说 明 ，对 于 紫 花 苜 蓿 体 胚 的 选 择 ， 延 迟 选 择 确 实 不 失为 一 种 有 效 的 筛 选 方 法 。负压处理时间（min/30s)田 4 农 杆 苗 傻 染 时 间 及 负 压 处 理 对 大 叶 苜 蓿表 1 脱 菌 方 式 对 转 化 效 果 的 彰 响脱 菌 方 式 接 种 体 胚 数 污 染 体 胚 数 污 染 率 （)固 体 脱 菌 74 27 36液 体 脱

30、菌 82 0 0表 2 选 择 方 法 对 体 胚 转 化 效 果 的 彩 响选 择 方 法 接 种 体 胚 数 抗 性 体 胚 数 转 化 率 （)前 期 选 择 69 4 6延 迟 选 择 64 20 31参 考 文 献 ：1 王 遵 亲 中 国 盐 渍 土 M*北 京 :科 学 出 版 社 ，1993.2 Flowers T J. Improving crop salt toleranceM. J Exp. Bot. , 2004,55 ； 307-319.3 王 金 ， 马 永 祥 ， 李 娟 ， 紫 花 苜 蓿 营 养 成 分 及 主 要生 物 学 特 性 J.草 业 科 学 ， 2

31、003,20(10) :3940.4 张 晓 琴 ， 胡 明 贵 .紫 花 苜 蓿 对 盐 渍 土 地 理 化 性 质的 影 响 J.草 业 科 学 ,2004， 21(11) :31-34.5 Zhang H X，Blumwald E. Transgenic salt tolerant tomato plants accumulate salt in foliage but not in fruitJ. Nat. Biotech. ,2001，19:765-768,6 Zhang H Joanna N H ,John P M,et al. Engineering salt tolerant

32、Brassica plant ： characterization of yield and seed oil quality in transgcnic plants with increase vacuolar sodium accumulation Jj. Pfoc. Natl. Acad Sci. USA, 2001,98 s 12832-12836.7 薛 哲 勇 ， 支 大 英 ， 夏 光 敏 ， 等 .根 癌 农 杆 菌 介 导 Ah JVHX1 基 因 转 化 小 麦 J.山 东 大 学 学 报 （ 理 学 版 ） ，2003,38:106-109.8 Yin X Y, Yan

33、g A F Zhang K Wal. Production and analysis of transgenic maize with improved salt tolerance by the introduction of AtNHXl geneJJ. Acta, Botanica Sinica，2004，46:854-861.9 Shahin Spielmann AfSukhapinda et al. Transformation of cultivated alfalfa using disarmed Agrobacterium tumefaciensJ. Crop Sci. , 1

34、986 26 ： 1235-1239.10 Hill K,Jarvis E NHalk Eet aL The development of virus-resistant alfalfa (Medicago sativa ) J. Bio. /Tech. , 1991，9:373-378.11 Shao C Y，Russinova E, lantcheva h， et al, Rapid transformation and regeneration of alfalfa ( Me diva go fale at a ) via direct somatic embryogenesis J.

35、Plant Growth Regulation,200031 ： 155-166.12 黎 茵 ， 黄 霞 ， 黄 学 林 .根 癌 农 杆 菌 介 导 的 苜 蓿 体 胚 转化 J.植 物 生 理 与 分 子 生 物 学 学 报 ， 2003,29: 109-113.13 黎 茵 ， 黄 学 林 ， 肖 洁 凝 ， 等 .根 癌 农 杆 菌 介 导 苜 蓿 体胚 转 化 及 转 基 因 植 株 再 生 J.中 山 大 学 学 报 (自然科学版），2004,43:79-85.14 周 冀 明 ， 卫 志 明 ， 许 智 宏 ， 等 .根 癌 农 杆 菌 介 导 转 化葛 菜 获 得 转 基 因 植 株 J.植 物 生 理 学 报 ， 1997, 23(1).21-28.15 郝贵霞，朱祯,朱 之 悌 .毛 白 杨 遗 传 转 化 系 统 优 化 的 研究 J.植物学报，1999,41(9):936-940.16 Lin J J, Assad G Kuo J. Plant hormone effect of antibiotics on the transformation efficiency of plant tissue by Agrobacterium tumefaciens J Plant Sci. ,1995,109:171-177.