1、齐齐哈尔大学毕业设计（论文）酸热法提取紫花苜蓿鲜草叶蛋白的工艺参数研究齐齐哈尔大学毕业设计（论文）I摘 要苜蓿（Medicago Sataiva L.）是世界上分布最广泛、最古老的豆科栽培牧草之一。苜蓿富含蛋白质、多种维生素和矿物质，是多种家畜喜食的优质蛋白质饲草和能量饲草，它既可用于饲料产业，同时近年也被用来开发研制成各种食品。苜蓿叶片中含有丰富的蛋白质，为一种良好的提取叶蛋白的原材料。本课题以紫花苜蓿鲜叶为材料，提取方法为酸热法。主要内容是用酸热法提取苜蓿鲜叶中的叶蛋白，本实验通过设置不同的提取温度、pH 值、絮凝时间三个单因素进行酸热实验来研究提取率。实验结果表明，酸热法实验各单因素最佳
2、参数分别为：温度为 50，pH 值为 4，絮凝时间为 10min。并在单因素基础上设计了响应面试验。然后对提取的叶蛋白进行氨基酸含量的测定分析。采取方法：本实验先用打浆机将苜蓿叶打浆，加盐，通过酸热、离心、干燥得到苜蓿叶蛋白，用凯氏定氮法测定不同条件下的蛋白质提取率，并作响应面试验选择最优条件。用选取的最优条件提取叶蛋白，做叶蛋白氨基酸的测定分析。通过氨基酸分析结果表明,苜蓿叶蛋白氨基酸种类全,含量高,氨基酸组成比例协调, 与成人氨基酸模式基本相符，因此苜蓿叶蛋白为优质蛋白质原。关键词 苜蓿；叶蛋白；酸热法；提取 齐齐哈尔大学毕业设计（论文）IIAbstractAlfalfa (Medicag
3、o Sataiva L.) is one of the worlds most widely distributed and the oldest cultivated forage legume . Alfalfa is rich in protein, vitamins and minerals, is favorite for livestock,a variety of high quality forage protein and energy forage,which it can be used for feed industries, while also being used
4、 in recent years develop into a variety of food. Alfalfa leaves are rich in protein, as a good raw materials for leaf protein extraction. The topic is alfalfa fresh leaves for the materials, samples are extracted with acid heating. Main content is that alfalfa leaf protein is extracted by acid heati
5、ng, by setting different extraction temperature, pH, flocculation time of three single factor experiments extraction rate is studied the hot acid. The result of the experiment shows that in the single factor acid thermal method experiment ,the best parameters is temperature 50 C，pH=4,coagulation tim
6、e is 10 minutes. Based on a single factor the response surface experimental is design. Then extracted leaf protein amino acid content is analysised. Methods is that: This study will first use the beater to beat alfalfa leaf, adding salt, by acid, heat, centrifugation, dried alfalfa leaf protein, wit
7、h the Kjeldahl nitrogen determination method for the determination of protein under different conditions, yield, and test for response surface choose the best conditions. Select the optimum conditions with leaf protein extract, made the determination of leaf protein amino acid analysis. The amino ac
8、id analysis show that all types of alfalfa leaf protein amino acid, high content of amino acid composition of coordination, in line with the adult basic amino acid pattern, so alfalfa leaf protein is the original high quality protein. Key words: Alfalfa; leaf protein; acid heating; extraction齐齐哈尔大学毕
9、业设计（论文）I目 录摘 要 .Abstract第 1 章 绪论.11. 1 紫花苜蓿概况 .11. 1. 1 紫花苜蓿的营养品质 .11. 1. 2 紫花苜蓿的应用价值 .21. 1. 3 苜蓿产品的开发应用现状 .31. 2 植物叶蛋白的研究概况41. 3 苜蓿叶蛋白提取51. 3. 1 苜蓿叶蛋白提取原理及方法 .51. 3. 2 提取叶蛋白后的副产品开发利用 .61. 4 本论文研究的意义与主要内容.71. 4. 1 本论文研究的意义 .71. 4. 2 本论文研究的主要内容 .7第 2 章 酸热法提取紫花苜蓿叶蛋白工艺研究 .82. 1 实验材料与仪器82. 1. 1 实验材料与试剂
10、 .82. 1. 2 实验仪器 .82. 2 实验测定方法82. 2. 1 凯氏定氮法测定溶液中蛋白质含量 .82. 2. 2 氨基酸分析 .92. 3 实验内容及方法 .112. 3. 1 实验工艺流程 112. 3. 2 操作步骤 112. 3. 3 苜蓿叶蛋白酸热工艺参数单因素实验 112. 3. 4 酸热工艺响应面试验设计 122. 3. 5 氨基酸含量分析 132. 4 计算公式.13第 3 章 结果分析 .143. 1 酸热提取苜蓿粗蛋白单因素实验.143. 1. 1 提取温度对粗蛋白提取率的影响 .14齐齐哈尔大学毕业设计（论文）II3. 1. 2 pH 对粗蛋白提取率的影响 1
11、43. 1. 3 酸热时间对粗蛋白提取率的影响 .153. 2 苜蓿叶蛋白酸热提取步骤的响应面实验 163. 2. 1 实验结果及方差分析 .153. 2. 2 响应面分析及等高线图 .153. 3 氨基酸分析 193. 4 实验细节分析与注意事项 223. 4. 1 实验细节分析223. 4. 2 注意事项. 22 结论 .24参考文献 .25齐齐哈尔大学毕业设计（论文）1第 1 章 绪论1. 1 紫花苜蓿概况紫花苜蓿具有适应性广、高产优质、改良土壤迅速、经济效益高、生态功能齐全的特性，素有“牧草之王”的美称，苜蓿在我国种植已有 2000 多年的历史，其具有特殊植物学和生物学特性体现在生物量
12、、营养价值和可食性等诸多方面的优异生产性能和经济价值，奠定了它在饲草生产中的基础地位。全世界苜蓿的栽培面积约为 3300000 hm2。我国紫花苜蓿栽培面积约 1333000 hm21。就苜蓿产业体系发展完善程度而言，美国居第一位，其次是阿根廷和加拿大。目前苜蓿在美国的种植主要集中分布在美国的西部和北部地区，种植面积仅次于玉米、小麦和大豆，但就其产值而言，美国各类饲草的总产值相当于小麦和大豆的总和，这其中苜蓿所占比重最大，粗略统计苜蓿干草的年产值达 81 亿美元。此外，美国苜蓿种子生产也占有相当大的一个份额。其他国家，如欧洲的西班牙、意大利、法国、罗马尼亚、保加利亚、匈牙利、南联盟等国，虽绝对
13、生产面积不大，但由于国土面积较小，苜蓿生产加工某种意义上也构成为本国农业的主要支柱产业，并且具有较高的产业化生产水平。就我国苜蓿发展，自西汉时期开始即由中亚引入进行栽培，逐步在全国北方地区普及生产，成为我国北方最重要的饲草及养地作物。目前随着草业观念的逐步确立，以及退耕还草的紧迫形势，苜蓿产品开发应用必将日益受到重视，它必将在农业结构战略性调整和肉、蛋、奶等第二性产品的生产中发挥重要作用。1. 1. 1 紫花苜蓿的营养品质紫花苜蓿的营养价值很高，含有很高的蛋白质含量、膳食纤维、丰富的矿物质和维生素等营养成分。1958年，美国农业局牧草委员会对大量的谷物和牧草的化学成分进行了测定，结果表明苜蓿具
14、有优良的营养品质 2，主要有以下几个特点：(1) 粗蛋白质含量高由于蛋白质含量与植株成熟度成极显著负相关, 即株龄越大, 粗蛋白含量越低。因此, 我们利用苜蓿的最佳时期为现蕾期或初花期。紫花苜蓿初花期粗蛋白质含量为16% 22%，一般为 18%左右 3。(2) 紫花苜蓿的 蛋白质大部分存在于叶片中苜蓿叶中的蛋白约占总蛋白的75%，最高可达80% 4，所以主要集中在叶蛋白方面齐齐哈尔大学毕业设计（论文）2对苜蓿蛋白质的食用价值进行研究。(3) 紫花苜蓿的 蛋白质具有优良品质利用苜蓿生产的叶蛋白饲料的粗蛋白含量高达32%58%，较大豆中的粗蛋白含量高，品质与大豆蛋白和豆饼蛋白接近，仅次于鱼粉。在饲
15、料能量价值方面，消化能和代谢能含量约为大豆的85%，与大豆饼、花生饼的含量相当。(4) 苜蓿的蛋白质中 氨基酸种类齐全, 组成比例较为平衡从氨基酸含量来看，精氨酸、谷氨酸、丝氨酸含量低于大豆蛋白，丙氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、胱氨酸、脯氨酸、苏氨酸、缬氨酸含量高于大豆蛋白，天门冬氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸含量与大豆蛋白相近。与联合国粮农组织推荐的成人氨基酸模式基本相符，特别地其中赖氨酸含量丰富，可以弥补谷类食品在这方面的不足 5，还常被用作儿童补充蛋白质的来源。(5) 紫花苜蓿 膳食纤维含量丰富苜蓿的可食纤维含量高达其株重的20% 6, 是最丰富的可食纤维来源之
16、一。叶中纤维占总纤维的25%，新鲜苜蓿绿叶经粉碎、榨汁和过滤后分离出的叶渣,含有70%以上的总膳食纤维干基含量。在食用价值方面，苜蓿是一种极好的天然果蔬类纤维源，可促进肠道蠕动，改善肠道的消化和吸收，也有轻泻作用。在饲用价值方面，苜蓿干草属粗饲料，但苜蓿中粗纤维可消化成分比例大，属优质纤维饲料。(6) 苜蓿中矿物质含量丰富包括P、Ca 、K、Na 、Cl、S、Mg、Cu 、Mn、Fe、Co、B、Mo等, 以及微量元素镍、铅、锶、钯等，是谷类种子的58倍 7。钙是促进骨骼和体格发育的重要元素,磷有利于智力发育。苜蓿中锌的含量也很高, 锌参与体内100多种酶的合成, 缺乏锌可降低有关酶的活性而影响
17、人体生长发育、免疫防卫、创伤愈合、生殖生育等生理功能。(7) 苜蓿中维生素含量全面而丰富包括维生素A、D、E、K、U、C、B 1、B 2、B 6、B 12、叶酸、泛酸、肌醇和烟酸 8, 特别是维生素A、E、K含量丰富。VA是人体必需的微量营养素之一 , 对视觉发育、免疫功能、生长发育等有重要作用。VE是一种重要的抗氧化剂, 能清除自由基、保护细胞结构的完整。VK在维持人体正常凝血过程中起着重要作用。1. 1. 2 紫花苜蓿的应用价值(1) 苜蓿在食品中的应用早在1916年，人们就开始广泛尝试，试图找到一种合适的加工方式将其应用到食品中 9。在食用叶蛋白安全性方面，Bui Huy Nhu Phu
18、c、Ogle B、Lindberg JE用木薯叶蛋白饲养猪做了近一年的试验 10，证明了其安全性。苜蓿初级加工品主要有苜蓿花粉食品、苜蓿芽菜、袋装苜蓿菜、脱水苜蓿菜、苜蓿罐头、苜蓿茶、苜蓿汁饮料、苜蓿齐齐哈尔大学毕业设计（论文）3粉、苜蓿冰淇淋、苜蓿挂面等。苜蓿花粉食品，生产原料是取苜蓿长出时（约10cm左右）取其内尖。苜蓿中蛋白质含量高，特别是其内尖、叶片和花序部分，可见，在食品中加入苜蓿花尖，可提高食物的营养。苜蓿芽又称西洋芽菜，盛产于美国，澳洲与中南美一带。苜蓿的嫩芽可被直接采摘来或经人工冻干、烘干作蔬菜食用。常见的如苜蓿芽的沙拉、三明治、苜蓿芽春卷等，是一种极有推广价值的保健蔬菜。苜蓿
19、的嫩芽亦可经精细加工炮制成苜蓿茶饮用 11，苜蓿汁饮料是一种新型的保健饮品，以初花期的新鲜优质苜蓿为原料，经清洗、热烫护色、破碎浸提、粗滤、煮沸可调配成晶莹透明，亮绿色，清爽，风味可口的保健饮品。在美国人们把苜蓿粉压成小方丁或者小圆片, 供食用。苜蓿冰淇淋是以紫花苜蓿为原料, 经科学调制而成的风味独特、营养丰富的冰淇淋, 其风味绵甜爽口,具有紫花苜蓿清爽味道。苜蓿含有丰富的蛋白质、膳食纤维及必需氨基酸中的赖氨酸, 具有很好的药用及保健功效。苜蓿挂面是将苜蓿加入到面粉中制成的, 可提高面条中蛋白质和膳食纤维的含量, 提高挂面的营养价值。苜蓿叶蛋白还可专门用作儿童食品 12，补充赖氨酸。苜蓿叶蛋白
20、作为食品，每100克中含热量397J，蛋白质60g，钙800mg，铁50mg，-胡萝卜素1.4g。(2) 苜蓿在饲料中的应用叶蛋白饲料的保水性、乳化性、胶质形成性均优于动物性蛋白饲料，因此易于加工，且不含动物性胆固醇，易于直接加入配合饲料制成颗粒饲料，满足各类畜禽以及水产动物的营养物质所需。给奶牛的基础日粮中添加青绿苜蓿可使牛奶中不饱和脂肪酸的含量上升 0.59%( 补饲 2.5kg) 和 0.05%( 补饲 5.0kg) 13。叶蛋白饲料产品的粗蛋白质含量在 45%65% ，是一种高品质的单胃动物蛋白质添加饲料。提取蛋白质后的苜蓿草渣中粗蛋白质含量约为 6%8%，经过烘干可制成颗粒饲料或进行
21、乳酸发酵，生产青贮饲料，用于饲喂草食家畜。1. 1. 3 苜蓿产品的开发应用现状(1) 苜蓿食品产品的开发应用现状开发功能性食品将是21世纪的食品开发重要领域。由于苜蓿特殊的营养价值和保健功能, 所以应大力研究和开发苜蓿食品。要采用先进的科学技术,尽可能避免和减少营养物质的损失, 生产高质量的保健食品。人们对苜蓿在食品中的应用做了较多的探索, 值得加强的研究包括征集和培育食用苜蓿品种, 食用品种应具有采收期长、纤维含量适中、植酸及其他抗营养因子少、适口性好等特点。开发高附加值的食品品种, 优化其生产工艺, 如能开发高纤维早餐食品和主食食品将大大提高苜蓿的应用价值,研究提高苜蓿深加工产品技术,
22、如提高叶蛋白的絮凝分离技术、纯化叶蛋白技术、膳食纤维活化技术等, 也会促进苜蓿在食品中的应用。总之苜蓿食品富含蛋白质、多种维生素和矿物质，是多种家畜喜食的优质蛋白质饲草和能量饲草，它既可用于青饲，同时也被用来开发齐齐哈尔大学毕业设计（论文）4研制成产品，当然这其中包括初级产品和进一步深加工而成的产品。初级产品包括有草捆、草粉、草颗粒和草块等；另外，苜蓿青贮的制作在青贮窖、青贮塔基础上，发展形成了高密度草捆青贮、拉伸膜裹包青贮等产品，归为初级产品一类，它同相同原料制成的其他产品相比，具有营养价值保存完好、生产成本低的优点，便于在各种差异较大的生产条件下推行，可以说具有相当广阔的市场前景。综上所述
23、，苜蓿产品的开发形式多样，但这里产品的开发与生产依该国具体的生产条件而异。(2)目前存在的问题长期以来苜蓿一直作为牧草看待，人们没有食用苜蓿的习惯，所以应该转变人们的观念，让人们认识到苜蓿的营养价值和保健功能。苜蓿有很浓厚的青草味，口感差，也是人们不食用苜蓿的一个重要原因，所以应该研究去除青草味的加工工艺。目前，人们已经采用加碱蒸煮法、乙醇处理法去除不良气味。苜蓿粗纤维含量很高，口感差，不宜直接使用，应该进行加工，添加到食品中，或者提取活性成分生产功能性食品。目前，苜蓿还没有引起食品企业的重视，所以还需要食品企业的研发人员的努力，以苜蓿为原料开发食品。利用苜蓿生产功能性食品还没有引起人们的足够
24、重视。虽然已经有许多研究发现苜蓿营养价值很高，具有保健功能，可以用于生产功能性食品，但还没有真正应用到生产，所以应该研究成熟的工业技术，进行规模化的食品生产。1. 2 目前国内外植物叶蛋白的研究概况植物叶蛋白的研究工作在国外开始比较早，相关叶蛋白的研究最初是在匈牙利（19241925） ，之后在英国（19361939） ，但其中多是属于试验性质的。直到 70 年代末，由于全球性饲料蛋白质的严重不足以及饲料大豆价格的猛涨，许多国家纷纷采用各种途径开发蛋白质饲料资源。80 年代初，国际上专门成立了“绿色植物研究协会” ，协调和交流叶蛋白的研究和开发。1982 年在印度召开了第一届国际叶蛋白研究会议
25、，以后在 1985 和 1989 年分别在日本和意大利召开了第二届和第三届国际叶蛋白研究会议，1993 年又在新西兰和澳大利亚联合召开了第四届国际叶蛋白研究会议。这些会议从叶蛋白研究的各个方面，包括植物资源、叶蛋白的性质及效用、生产技术及开发利用等进行了广泛的讨论。英、澳、匈、美等国先后大规模开展了叶蛋白研究开发工作，为数众多的国家实现了叶蛋白的工业化商品生产。现在世界上许多发达和发展中国家，如美国、英国、法国、巴西、印度、新西兰、匈牙利等都修建起了大规模的叶蛋白加工工厂，把发展叶蛋白加工工业作为解决蛋白质饲料供给不足的主要措施之一。到目前为止，已有 70 多个国家相继开展了这方面的研究工作。
26、叶蛋白研究工作在我国开始较晚。我国最早在 50 年代中期由西北畜牧兽医学院畜齐齐哈尔大学毕业设计（论文）5牧系对叶蛋白以“饲料膏”的名称进行试验，到 80 年代后期对叶蛋白的生产展开了大量研究。研究的主要方向是饲用而非人用，研究的主要内容有：对蛋白资源进行了广泛的研究；对蛋白干粉的研究和应用。由于种种因素的影响，致使我国目前苜蓿叶蛋白的研究主要集中在实验室内对提取叶蛋白的原料、提取方法以及影响苜蓿提取率等方面，但尚无苜蓿叶蛋白大规模化生产。1. 3 苜蓿叶蛋白提取1. 3. 1 苜蓿叶蛋白提取原理及方法叶蛋白的意义：叶蛋白是指刈割新鲜的、有利用价值的饲草或其他植物的地上部分（嫩叶或嫩茎叶），经
27、压榨后，通过汁液提取、蛋白凝聚与分离干燥得到的蛋白质浓缩物，简称为叶蛋白（LPC） 14。叶蛋白提取的原理:天然蛋白质是一种由多种氨基酸构成多肽再由多肽链按一定规律排列成具有三级结构的物质，一般在溶液中是以稳定存在的。亲水胶体的状态主要是由于水化作用和电荷排斥作用的结果。水化作用即蛋白质分子表面附有一层水化膜，能有效防止蛋白质分子的沉淀析出。电荷排斥作用即蛋白质分子周围除水化膜外还有电荷层，能有效防止蛋白质分子的凝聚。因此如果加入影响这些因素的物质，破坏其稳定性就能使蛋白质发生聚集而沉淀。另外还有一些因素如其受热时(l00)而变性，三级结构破坏、以破坏氢键、盐键的结构，从而使蛋白质的生物性质和
28、理化性质发生改变，使蛋白质变性从而引起溶解度降低。叶蛋白的提取就是利用以上原理，将富含蛋白的植物经过切碎、捣浆、榨汁，在一定提取工艺条件下使溶解、分散于水中的蛋白质变性而凝结经过滤、干燥而形成蛋白质产品。但以蛋白质的品质要求来讲，利用蛋白质变性沉淀的方法不可取。常用的叶蛋白提取方法有以下几种:加热凝聚法、酸化加热凝聚法、碱化加热凝聚法、纤维素酶法、乳酸发酵法等。(1) 加热凝聚法是传统叶蛋白生产工艺中最常用的方法，是应用最早、最为普遍的一种絮凝法，大多数有关叶蛋白营养成分的分析结果出自热法提取的叶蛋白产品。这种工艺可提取出叶片中51%以上的真蛋白。不同加热温度条件下凝集出来的叶蛋白组分有所不同
29、，6080是叶绿体蛋白质凝集所需要的温度，而8090则是细胞质蛋白凝集所需要的温度。当浆液的温度超过而且瞬间加热凝集出的蛋白质团块大而且结实，易于齐齐哈尔大学毕业设计（论文）6进一步分离。加热法能使多种活性酶受到破坏，特别能破坏脱酶叶绿素产生的叶绿素酶，使叶绿素得到保护。最常用的加热法是迅速升温至适宜温度，其絮结效果和酶类钝化效果均较好。(2) 酸热凝聚法酸法的原理是与碱法的原理相似。其中酸法是利用盐酸等将汁液的pH 值调节至4左右直至产生叶蛋白沉淀，通过离心分离和干燥得到粗蛋白，它操作方便、无须加热、节约能源、成本低、沉淀快、可减少生物碱含量，但此类絮凝物结构疏松，不易过滤分离，还加速了不饱
30、和脂肪酸的氧化，胡萝卜素的损失增多。酸热法则是在浆液pH 值为2.55.5，并加热到4060条件下使蛋白质凝集的提取工艺。(3) 碱热凝聚法碱热凝聚法的原理是利用蛋白质在等电点条件下或强碱作用下能变性沉淀的特性，将pH值调节至强碱条件(大于10)，以产生较好的絮凝效果。可破坏多种不利因子，如一些酶类、植物雌激素和皂素等;碱热法是在加热法的基础上进一步采取加热措施，让浆液温度达到5060，使叶蛋白更为迅速地析出，碱热法要求的pH 值略低于碱法，7.59.5即可。(4) 纤维素酶法本试验将纤维素酶应用于叶蛋白的提取。利用酶本身的特性，破坏束缚蛋白质的细胞壁，提高蛋白质的溶出率，再加入酸性物质调节溶
31、液的pH 值到等电点而沉淀叶蛋白，具有蛋白质提取效率高、凝集迅速和叶蛋白加工损失率低等优点。(5) 乳酸发酵法由于蛋白质是一种两性胶体，当它所带正负电荷相等时，蛋白质就会产生聚凝。乳酸发酵法就是利用乳酸菌在发酵过程中产生的发酵酸(以乳酸为主)作叶蛋白的沉淀剂将蛋白质凝集析出的提取工艺。1. 3. 2 提取叶蛋白后的副产品开发利用提取叶蛋白后的副产品草饼和脱蛋白液中仍含有相当数量的营养物质，其用途广泛，有极高的开发研究价值 15。(1) 用于提取天然色素 苜蓿植株中含有叶绿素、叶黄素、胡萝卜素和类胡萝卜素等天然色素，提取后可替代人工合成色素添加入禽类饲料或水产动物饲料中，以提高其商品价值。 (2
32、) 草饼 草饼为鲜草榨汁后的剩余物。据 G.Anelli（1985）研究报道，鲜苜蓿草饼的含水量为 65%，营养成分以干物质计为粗蛋白含量 12.2%，粗脂肪含量 1.8%，粗纤维含量28.6%，无氮浸出物含量 50.1%，粗灰分含量 7.3%，各种矿物质含量不论鲜草还是草饼齐齐哈尔大学毕业设计（论文）7均能满足家畜生产所需。鲜草饼还可采用普通的干燥方法加工成干草饼，便于贮存饲喂；鲜草饼亦可青贮后饲喂家畜，不失为家畜的优质饲料。1 .3. 2. 3 脱蛋白液 脱蛋白液又称棕色液是鲜草压榨后所得的绿色汁液在分离了叶蛋白后的剩余残液，其中尚有 11%20% 的残留干物质，多半是糖和含氮化合物，还有
33、较多的维生素和有机物等。以前脱蛋白液常被作为废液而处理，现在随着生产工艺的改进和科学研究的不断深入，可将其浓缩后所得成分糖蜜作为动物饲料，或直接用作肥料，也可以作为生产醇类或食品酵母的工业原料即用作酵母培养基、甲基发酵培养基、乙醇发酵培养基等。综上所述，苜蓿副产品的开发形式多样，但这里产品的开发与生产依该国具体的生产条件而异，比如说在美国的 Oklahoma 州，由于先进的干燥技术和便利的运输条件，苜蓿大多用于草捆生产，而在北美，苜蓿多用来调制青贮。但无论哪一种产品都从根本上弥补了饲草资源季节不平衡问题，改善了生长季“相对过剩” 资源的利用率，缓解了枯草期蛋白质资源不足与畜牧业健康、持续、稳定
34、发展的矛盾。1. 4 本论文研究的意义与主要内容1. 4. 1 本论文研究意义通过酸热法提取苜蓿叶蛋白的研究，找出提取苜蓿叶蛋白的最合适条件，将其从实验室研究推广到大规模工业生产中。随着我国西部大开发战略的实施，退耕还草的推进，必将促进我国新一轮草产业的兴起。据预测，到 2020 年我国蛋白质饲料资源需求为 7200 万吨 16。苜蓿以独有的营养与保健功效将在绿色食品的市场上占有一席之地17。研究苜蓿在饲料和食品中的应用，拓宽其应用领域具有重要的现实意义。1. 4. 2 本论文研究的主要内容本课题研究的主要内容是用酸热法提取苜蓿叶中的叶蛋白，通过设置不同的温度、pH 值、絮凝时间来研究提取率。
35、(1)确定苜蓿叶叶蛋白提取的工艺流程。(2)做酸提取叶蛋白试验。在单因素试验的基础上，确定酸提取过程的最佳参数，实验设计的方法为响应面设计。 （以蛋白质提取率为指标，确定最佳温度、pH 值、絮凝时间。 ）(3)在最佳酸热条件下，得到苜蓿叶蛋白产品，测定其中的氨基酸含量。齐齐哈尔大学毕业设计（论文）8第 2 章 酸热法提取紫花苜蓿叶蛋白工艺研究2. 1 实验材料与仪器2. 1. 1 实验材料与试剂紫花苜蓿鲜叶 黑龙江畜牧研究所氯化钠 分析纯 天津市科密欧化学试剂开发中心盐酸 分析纯 天津市科密欧化学试剂开发中心 氢氧化钠 分析纯 天津市东丽区天大化学试剂厂硫酸铜 分析纯 天津市凯通化学试剂有限公
36、司硫酸钾 分析纯 天津市凯通化学试剂有限公司硫酸 分析纯 沈阳市华东试剂厂无水碳酸钠 分析纯 西安化学试剂厂硼酸 分析纯 天津市东丽区天大化学试剂厂2. 1. 2 实验仪器微型粉碎机 济南激流实业公司台式离心机 上海安亭科学仪器厂循环水式离心泵 巩义市予华仪器有限责任公司电子万用炉 天津市泰斯特仪器有限公司UV 紫外可见分光光度计 上海欣茂仪器有限公司 电子天平 北京塞多利斯仪器系统有限公司分析天平 北京塞多利斯仪器系统有限公司电热恒温鼓风干燥箱 上海跃进医疗器械厂PHS-25(数显)pH 计 上海精密科学仪器有限公司Thermo 702 型低温冰箱 Thermo Electron Corpo
37、ration水浴恒温振荡器 上海跃进医疗器械厂齐齐哈尔大学毕业设计（论文）9L-8900 全自动氨基酸分析仪 日立 Hitachi2. 2 实验测定方法2. 2. 1 凯氏定氮法测定溶液中蛋白质含量(1) 试样处理称取一定质量的的叶蛋白试样质量，移入洁净干燥的 500ml 凯氏烧瓶中，加入0.6g 硫酸铜粉末，6g 硫酸钾，然后用移液管移取 20ml 浓硫酸，放入两粒小玻璃珠（防爆沸） ，摇匀后在瓶口放置一小漏斗。在电炉上放置石棉网，将凯氏烧瓶以 45角支于石棉网上。开通风橱，开电路开关，用小火加热至全部炭化，加大火力保持液体微沸。待液体变为蓝绿色澄清溶液后，持续加热 0.5h，然后取下，使其
38、在室温中冷却。移入 50ml 容量瓶，并用少量水洗定氮瓶，定容， 静置备用。(2) 吸收用蒸馏水清洗凯氏定氮仪，在漏斗中加入 2ml 消化液，用移液管从漏斗加入 10ml 40%NaOH，用少量水润洗漏斗，再加少量蒸馏水液封漏斗。用移液管移取 5ml 的 4%硼酸溶液于 50ml 三角瓶中，加入 1 滴指示剂，溶液变为浅粉色。冷凝管下端插入预先加入吸收液的三角瓶液面以下，开电路开关，用电炉蒸馏。吸收液由紫红色变为绿色时开始计时 10min，然后将冷凝管提离液面再蒸馏 1min。用蒸馏水冲洗冷凝管尖端后停止蒸馏。(3) 滴定用 0.01molL 的 HCL 滴定吸收液，浅粉色为滴定终点。2. 2
39、. 2 氨基酸分析(1) 前处理取样：若样品中蛋白质含量为 40-50%，则称样量为 0.06g 左右（不能低于0.05g） ；若样品中蛋白质含量为 11-15%，则称样量为 0.13-0.15g。样品均置于干燥小试管中。于每支试管中加入 6.67M 盐酸 9ml。用酒精喷灯烧试管的中上部，用镊子将试管的中上部抻细。用氮吹仪封管：将氮吹仪钢针插入每只已抻细的试管中，吹氮气 10min，取下，齐齐哈尔大学毕业设计（论文）10在火焰上封管。酸水解：将封好的试管放在 110的烘箱中进行酸水解，14-24h。定容：用 8.5ml 氢氧化钠溶液将试管液调至 pH 值=2.2 ，然后将试管液移入100ml
40、 容量瓶中，并用缓冲液洗试管，定容。过滤：用滤纸将容量瓶中液体过滤，再用一次性针头过滤器过滤。过滤后液体注射入样品瓶中，样品瓶上机分析。(2) 上机分析(3) 氨基酸的评价方法采用氨基酸比值系数法：食物蛋白质中各类蛋白质的氨基酸组成比例虽不尽相同，但其营养价值的优劣主要取决于所含必需氨基酸（essential amino acid，EAA）的种类、数量和组成比例，其所含的EAA 的组成比例越接近人体需要氨基酸的比例，则其质量就越优。据此，世界卫生组织（WHO ）和联合国粮农组织（ FAO）1973年提出了评价蛋白质营养价值的必需氨基酸模式。氨基酸比值系数法，即根据氨基酸平衡理论，利用WHO/F
41、AO 的必需氨基酸模式计算样品中EAA的氨基酸比值（ratio coefficient of amino acid，RC）和比值系数分（score of RC ，SRC）。RAA= （2-1）)/(EA/ mg蛋 白 质含 量式 中 相 应 的 蛋 白 质 ）含 量 （待 评 蛋 白 质FAOWHRAA 在有些文献中亦称之氨基酸分（amino acids score，ASS） ，其含义为某种食物蛋白质中某种 EAA 含量相当于模式相应 EAA 的多少倍。RC= （2-2）之 均 数RA由于一般食物各种氨基酸比值往往不相同，故可计算氨基酸比值的均数。如果食物蛋白质氨基酸组成含量比例与模式氨基酸一
42、致，则各种 EAA 的 RC 应等于 1，数值大于或小于 1 均表示偏离氨基酸模式， RC 1 表明该种 EAA 相对过剩，RC 0.05），自变量X 2（pH 值）对Y（苜蓿叶蛋白提取率）影响高度显著（p=0.00040.05 ）。同时，X 1X 2和X 3的回归系数均为负值，使Y线性降低。X 1的平方项对Y的影响显著（p0.05），然而交互项作用均不显著（ p0.05）。用SAS RESRSG（Response Surface Regression）程序进行分析，由此获得方差分析表（表3-3 ）。由方差分析结果可知，回归方程高度显著（p=0.00400.01），并且该模型的R 2=0.96
43、48，说明模型可以解释96.48%实验所得苜蓿叶蛋白提取率的变化,表明该模型与实际实验拟合较好，自变量与响应值之间线性关系显著，可以用于酸热法提取苜蓿叶蛋白实验的理论预测。回归方程各项的方差分析结果表明方程的一次项和二次项的影响是高度显著的（p0.05）齐齐哈尔大学毕业设计（论文）18表3-3方差分析Tab 3-3 Analysis of variance(ANOVA)for the response surface model方差来源 自由度 离差平方和 R2 F值 PrF一次项 3 226.966525 0.4935 23.33 0.0023二次项 3 212.314052 0.4617
44、21.83 0.0027交互相 3 4.404125 0.0096 0.45 0.7267模型 9 443.684702 0.9648 15.21 0.0040残差 5 16.210992总离差 14 459.8956943. 2. 2 响应面分析及等高线图（a）齐齐哈尔大学毕业设计（论文）19（b）(c)图 3-4 苜蓿叶蛋白提取率的响应面及等高线图(a) 固定水平： X3=0 (b) 固定水平：X2=0 (c) 固定水平：X1=0Fig.3-4 Response surface and contour plot of the extraction efficiency of leaf pr
45、otein(a) Fixed level:X3=0 (b) Fixed level:X2=0 (c) Fixed level:X1=0响应曲面及其等高线如图 3-4 所示，各因素及其交互作用对响应值的影响趋势可齐齐哈尔大学毕业设计（论文）20通过这组图直接反应出来。从图中可以看出，各因素之间对模糊综合评价值评价的影响有协同作用，X 1（提取温度） 、X 2（pH 值）对响应值的影响较大，表现为曲线较陡，而 X3（加热时间）对响应值的影响较小，表现为曲线相对平滑。另外，回归方程存在稳定点，稳定点是极大值点，通过岭嵴分析（ridge analysis）得到极大值。所对应的各主要因素（X 1，X 2
46、，X 3）的编码值分别为（-0.035464，-0.378192，0.006525） ，即最佳条件是：提取温度 49.6pH3.2、加热时间 10min，此时叶蛋白提取率可以达35.64%，与模型的预测值（35.66%）基本相符。3. 3 氨基酸分析苜蓿叶蛋白氨基酸分析结果见表3-4,苜蓿叶蛋白氨基酸种类齐全,含量高,氨基酸比例协调,是一种高效的植物蛋白饲料。表3-4 苜蓿叶蛋白浓缩物中氨基酸含量(%)序号 名称 叶蛋白(%)1 天冬氨酸(Asp) 1.412 苏氨酸(Thr) 0.593 丝氨酸(Ser) 0.534 谷氨酸(Glu) 1.245 甘氨酸(Gly) 0.626 丙氨酸(Ala
47、) 0.707 半胱氨酸(Cys) 0.048 缬氨酸(Val) 0.689 蛋氨酸(Met) 0.1710 异亮氨酸( Ile) 0.5011 亮氨酸(Leu) 0.9812 酪氨酸(Tyr) 0.3013 苯丙氨酸(Phe) 0.8614 赖氨酸(Lys) 1.6815 组氨酸(His) 0.2816 精氨酸(Arg) 0.6717 脯氨酸(Pro) 1.5518 总计 13.3苜蓿叶蛋白氨基酸分析结果见表3-5:苜蓿叶蛋白中必需氨基酸的含量丰富 ,必需齐齐哈尔大学毕业设计（论文）21氨基酸含量占氨基酸总含量的43.6% ,必需氨基酸与非必需氨基酸含量的比值为0.77，分别高于FAO/ W
48、HO 标准规定的40%和0.6 ,因此苜蓿叶蛋白可以提供优质蛋白质。营养学告诉我们，蛋白质的营养质量主要取决于它的氨基酸组成与比例，尤其是必需氨基酸的组成与比例。如果必需氨基酸齐全，配比得当，接近或符合 FAO/ WHO氨基酸模式要求，则这种蛋白质适宜人体生理作用需要，营养价值大。 按照公式(2-1)、(2-2)、 (2-3): 分别计算 RAA、RC 、SRC，其值见表 3-6。苜蓿叶蛋白的第一限制氨基酸为半胱氨酸。我们可以根据蛋白质互补法，苜蓿叶蛋白和其它的叶蛋白或其它半胱氨酸丰富的蛋白质按一定比例互混合,从而可以取长补短、互相补充,充分利用其营养价值。表 3-5 苜蓿叶蛋白必需氨基酸的含
49、量 mg/g材料 FAO/ WHO 苜蓿叶蛋白浓缩物异亮氨酸( Ile) 40 5.0亮氨酸(Leu) 70 9.8赖氨酸(Lys) 55 16.8蛋氨酸 + 半胱氨酸（Met、Cys) 35 2.1苯丙氨酸+ 酪氨酸（Phe、Tyr） 60 11.6苏氨酸(Thr) 40 5.9缬氨酸(Val) 50 6.8表 3-6 苜蓿叶蛋白浓缩物和其它蛋白的氨基酸比值，氨基酸比值系数及氨基酸比值系数分的比较材料 Ile Leu Lys Met + Cys Phe + Tyr Thr Val SRC苜蓿叶蛋白浓缩物 47.93RAA 0.125 0.140 0.305 0.060 0.193 0.148 0.136RC 0.791 0.886 1.930 0.380* 1.222 0.937 0.861花生叶蛋白 20 88.68RAA 0.464
