1、黄曲霉毒素测定法黑龙江省食品药品检验检测所2015-12李广生黄曲霉毒素的发现及简介黄曲霉毒素的危害各国药典现行的检测方法黄曲霉毒素检测方法简介检测过程中应注意的事项我国现行法定检测方法详解一、黄曲霉毒素的发现及简介霉变就会产生黄曲霉毒素？黄曲霉毒素是由 黄曲霉 和 寄生曲霉 在生长后期分泌产生的一类次级代谢产物一、黄曲霉毒素的发现及简介1960年，在英国东南部一些农场中，有大约10万只火鸡不明原因地突然死亡。1961年发现火鸡饲料中混有的花生粉能够使大鼠诱发肝癌。1962年研究发现花生粉中含有一种荧光物质是导致火鸡死亡的病因。黄曲霉毒素的种类目前已发现的黄曲霉毒素有 AFBl、 AFB2、
2、AFG1、AFG2、 AFB2a、 AFG2a、 AFM1、 AFM2、 AFPl等二十种左右。一、黄曲霉毒素的发现及简介 基本结构是由一个双呋喃环和香豆素构成。一、黄曲霉毒素的发现及简介黄曲霉毒素的理化性质一般特性：几乎是无色，分子量为 312 346。 B1的分子量为 312荧光特点：在 365nm紫外照射下可产生荧光， B族毒素显蓝紫色荧光； G族毒素显黄绿色荧光溶解特性：难溶于水，石油醚和乙醚；易溶于氯仿、甲醇、丙酮、苯、乙腈等多种有机溶剂一、黄曲霉毒素的发现及简介 稳定性对热稳定，分解温度 300中性和酸性溶液中很稳定在强碱 (pH9-10)溶液中可被迅速分解5的次氯酸钠溶液可瞬时破
3、坏毒素有很高的储藏稳定性一、黄曲霉毒素的发现及简介二、黄曲霉毒素的危害黄曲霉毒素是目前为止已知的最强致癌物之一，其毒性远远大于氰化物、砷化物和有机农药的毒性。诱发动物肝癌的能力为二甲基亚硝胺的 75倍、黄曲霉毒素可在动物体内代谢，进行脱甲基、羟化和环氧化反应，形成具有强致癌活性的物质 。毒性二、黄曲霉毒素的危害急性毒性 :对动物毒害作用的靶器官主要是肝脏，可引起肝实质细胞坏死，胆管上皮增生，肝出血等病变。黄曲霉毒素 B1对鸭雏的致死中量 (LD50)为 364g/kg,小白鼠的 LD50为 5 7mg/kg。 （经口给药）慢性毒性：动物肝脏出现亚急性或慢性损伤，引起肝脏纤维细胞增生，肝硬化；动
4、物表现生长发育缓慢、体重减轻等生长障碍现象。 易污染黄曲霉毒素的商品主要有谷物、棉籽、花生、调味品、玉米、小麦、大米、坚果、牛奶、禽蛋、无花果、粮油制品、家庭自制发酵食品等。二、黄曲霉毒素的危害三、各国药典现行检测方法1.韩 国中药材中黄曲霉毒素 B1限量标准和试验方法（韩国食品药品安全厅公告第 2008-4号）适用范围：甘草、决明子、桃仁、半夏、柏子仁、槟榔、酸枣仁、远志、红花（ 9种）限量标准：黄曲霉毒素 B110g/kg提取方法： 水 /甲醇混合液（ 3： 7）超声提取，免疫亲和柱净化，甲醇洗脱测定： HPLC，柱后衍生；荧光检测2.欧洲药典适用范围： herbal drugs（中草药）
5、限量标准：黄曲霉毒素 B12g/kgB1、 B2、 G1、 G2总量 4g/kg提取方法：水 /甲醇混合液（ 3： 7）超声提取，免疫亲和柱净化，甲醇洗脱测定： HPLC，柱后衍生；荧光检测三、各国药典现行检测方法3.美国药典 USP适用范围： material of plant origin（植物来源材料）限量标准：黄曲霉毒素 B15g/kg， B1、 B2、 G1、 G2总量20g/kg提取方法： 甲醇 /水（ 17:3）振荡提取，部分提取液以氯 化钠溶液稀释后，正己烷脱脂，再用三氯甲烷萃取。净化：硅胶柱测定： TLC UV365nm三、各国药典现行检测方法四、黄曲霉毒素测定方法简介薄层色
6、谱法金标试纸条（现场使用，样品初筛）酶联免疫吸附（ ELISA）法荧光光度法HPLC法 （中国药典，测 B1/ B2/ G1/ G2 含量）薄层色谱法在分析仪器还未普及的时代，作为一种经典的分析方法，是一种半定量检测方法，它的检出限在5ppb以上，不能满足现有的限度规定要求，并且操作繁琐，有机试剂用量大，准确率低，正逐渐被其他更好的检测方法所取代。酶联免疫吸附法（ ELISA）由于许多中药具有与黄曲霉毒素相似化学成分，易产生假阳性。荧光光度法测定黄曲霉毒素总量，专属性不高，存在假阳性问题。四、黄曲霉毒素测定方法简介 中国药典 2010年版一部僵蚕、陈皮、酸枣仁、桃仁、胖大海 测定方法： HPL
7、C通过柱后衍生化使用荧光检测器测定五、我国现行法定检测方法详解 中国药典 2015年版一部增加了柏子仁、莲子、使君子、槟榔、麦芽、肉豆蔻、决明子、远志、薏苡仁、大枣、地龙、蜈蚣、水蛭、全蝎等 14药材及饮片。五、我国现行法定检测方法详解黄曲霉毒素在紫外光照射下能产生荧光，但黄曲霉毒素 B1和 G1的荧光在含水的溶剂中能发生淬灭，导致荧光减弱，严重影响测定方法的灵敏度。为什么要衍生？五、我国现行法定检测方法衍生类型一、柱前衍生：三氟乙酸 B1 B2aG1 G2a二、柱后衍生：光化学柱后衍生加热柱后衍生（溴或碘柱后衍生）电化学衍生碘 衍 生 原 理I2I2五、我国现行法定检测方法光化学衍生的原理h
8、VhV五、我国现行法定检测方法五、我国现行法定检测方法测定设备Waters：液相： 2695荧光检测器： 2475柱后碘衍生化设备五、我国现行法定检测方法衍生条件衍生溶液： 0.05%的碘溶液衍生化泵流速： 0.3ml/min衍生化温度： 70 缺点：1.衍生液中的碘易析出，容易堵塞管路。2.持续的碘溶液易污染检测器光化学衍生设备 优点：1.安装调试简单，开机即可用。2.不需要衍生剂，节约试剂，延长仪器寿命。3.无需冲洗步骤4.价格便宜五、我国现行法定检测方法衍生化条件： 254nm五、我国现行法定检测方法色谱条件与系统适应性试验色谱柱： C18时间（ min) A:乙腈（ %） B： 甲醇（
9、 %） C： 水（ %）0 10 25 6517 10 45 4520 10 65 2522 10 65 2523 10 25 65 中国药典 2010年版一部（碘衍生）：甲醇 -乙腈 -水（ 40： 18： 42） 流速 0.8ml/min流动相 中国药品检验标准操作规范 2010年版 :流速 1.1ml/min 中国药典 2010年版第二增补本 :甲醇 -乙腈 -水（ 40： 18： 42）波长：激发波长 360nm（或 365nm），发射波长 450nm流动相：可根据实际情况进行微调，如变动较大应进行方法确认五、我国现行法定检测方法色谱条件与系统适应性试验对照溶液的制备：黄曲霉毒素混标（
10、 B1、 B2、 G1、 G2浓度分别为 1.0、 0.3、 1.0、 0.3g/ml） 贮备液：精密量取 0.5ml，甲醇定容至 10ml量瓶中。 工作溶液：精密量取 1ml储备液，甲醇定容至 25ml量瓶中（现用现配） 进样体积： (5、 10、 15、 20、 25)l,计算标准曲线 。五、我国现行法定检测方法供试品溶液制备取样（取样法）：粉碎后过 2号筛，取 15g或按各品种项下规定，加氯化钠 3g。 陈 皮： 5g 酸枣仁： 5g 胖大海： 5g 五、我国现行法定检测方法 提取溶剂： 70%甲醇 75ml供试品溶液制备五、我国现行法定检测方法提取方法：匀浆处理（高速搅拌 2min，大于 11000r/min）、振荡或超声 20min。 样品离心 5min（ 2500r/min），精密量取上清液 15ml，加水定容至50ml，摇匀，（ 0.45m）滤过。精密量取续滤液 20ml，通过免疫亲合柱，流速 3ml/min，加水 20ml洗涤（弃去），使空气通过柱子，加甲醇洗脱，洗脱液收集到 2ml容量瓶中，加甲醇至刻度。 进样体积： 20 25l（可视灵敏度调整），保证样品峰面积在标准曲线内。供试品溶液制备五、我国现行法定检测方法
