1、 1粮油检测 粮食中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定超高效液相色谱方法行业标准制定编制说明脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON)，又名呕吐毒素，是由镰刀菌属（Fusarium）的禾谷镰刀菌、黄色镰刀菌、头孢菌属、漆班菌属、木霉属等菌株产生的代谢产物，主要污染小麦、玉米、大麦等，具有很强的毒性。2003年我国对小麦、玉米、稻谷中DON 的污染情况调查显示小麦、玉米DON 污染较稻谷严重。我国在2005年颁布了粮食和食品中DON的限量标准，2011年颁布了国家食品安全标准-食品中真菌毒素限量 规定小麦、玉米中DON的最高限量为1 000 /kg。目前 DON 的检测方法主要有薄层色谱、胶体金试纸条法、气相色谱或气质
2、联用、液相色谱或液质联用 、酶联免疫法 、免疫亲和层析净化高效液相色谱法等方法。酶联免疫、试纸条等方法不能用于准确定量；普通液相色谱方法的灵敏度相对较低，分析速度较慢，耗费溶剂较多，在食品安全标准规定的限量附近分离效果有时不理想；气相色谱或气质联用需衍生后检测；液质联用仪检测需要高端的质谱仪。当前急需建立一种更加灵敏、高效、低溶剂量、不需要衍生、不需要高贵仪器的 DON 微量快速定量方法。为了满足当前我国粮食绿色检测、监测定量分析的需要，通过查阅文献，根据范德米特(van Deemeter)方程理论，结合免疫亲和净化手段，基于UPLC分离技术，建立了一种进样量小、分离度高、快速准确、环保的脱氧
3、雪腐镰刀菌定量分析方法。本标准项目的研究有助于提高粮食样品检测、监测效率，降低成本，保护环境，保障从业人员健康安全。本标准对后续标准制定，以及粮食污染黄曲霉毒素的相关科研、标准制定起到较好的指导、参考、促进作用。1 工作简况1.1 任务来源及起草单位根据 2012 年粮油行业标准制定计划的要求，由国家粮食局科学研究院负责粮油检测 粮食中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定 超高效液相色谱方法起草工作，该方法也是国家 863 项目“粮食产后生物性危害物快速检验监测技术” （项目编号 2012AA101609）的研究内容之一。起草单位成立的标准起草组负责进行本标准的各项工作。1.2 标准研制主要工作过程（1）
4、根据该标准的特点，2012 年 5 月-2012 年 7 月，查询了国内外资料，对相关检测机构、粮库、粮食加工企业进行了调研，并召开了第一次讨论会，确定了标准制订方案和工作计划。（2）2012 年 8 月-2012 年 12 月，在国家粮食局科学研究院实验室进行标准的研制工作，主要2包括方法的建立，方法灵敏度测试，方法的线性范围确定，方法的回收率研究等。（3）2013 年 1 月-3 月，编写了 粮油检测 粮食中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定 超高效液相色谱方法标准草案，并召开了第二次讨论会。（4）2013 年 4 月-9 月，在不同厂家的快速液相色谱上进行方法的验证。（5）2013 年 10 月-
5、11 月，标准草案的意见征询。（6）2015 年 3 月-2015 年 7 月，行业验证。(7)2015 年 8 月-至今，标准文本修改 ,形成送审稿。2 标准的编制原则和标准的主要内容2.1 标准编制原则本标准是根据 GB/T1.1-2009标准化工作导则第 1 部分：标准的结构与编写规则 、GB/T20001.4-2009标准编写规则第 4 部分：化学分析方法的规定进行编制的。2.2 确定标准主要内容2.2.1 标准的适用范围本标准规定了免疫亲和层析净化快速高效液相色谱法测定谷物及其制品中脱氧雪腐镰刀烯醇的条件和详细分析步骤。本标准适用于小麦、玉米、稻谷等粮食及其制品中脱氧雪腐镰刀烯醇的测
6、定。本标准方法脱氧雪腐镰刀烯醇的检出限为 0.05mg/kg。2.2.2 标准研制的总体思路2.2.2.1 仪器与试剂快速高效液相色谱仪：配备荧光检测器和数据处理系统。色谱柱：C 18 柱（50 mm3 mm，1.7m,或相当者） 。脱氧雪腐镰刀烯醇免疫亲和柱；玻璃纤维滤纸；0.22 m 有机滤膜；6 位泵流操作架；电子分析天平；高速旋转粉碎机；高速均质器；氮吹仪；多功能振荡器。脱氧雪腐镰刀烯醇标准品，甲醇（色谱纯） ，超纯水。其它试剂和材料见标准送审稿。2.2.2.2 检测波长的选择实验过程中采用流动相作为背景溶液，用 PDA 检测器对呕吐毒素标准液在 190400 nm 进行全波长紫外扫描
7、（见图 1） 。结果表明，呕吐毒素在 220 nm 处有最大吸收，且杂峰和基线噪音干扰少，本实验选择检测波长为 220 nm。34.796 取20 30.5340.5.385.9AU0.0.20.40.60.8取250. . . 40.图 1 DON 的紫外扫描谱图Fig. 1 UV spectrum of DON2.2.2.3 流动相的优化呕吐毒素属于极性化合物，流动相以水作为基础溶剂，考察了甲醇-水、乙腈- 水两种溶液组合和不同配比作为流动相时对色谱分离效果的影响，结果表明选用甲醇-水（1090）和乙腈- 水（1090）作为流动相时，目标峰与样品中的杂峰均分离良好，色谱峰形相对尖锐、对称，
8、流动相配比简单。考虑到甲醇的毒性较小、价格相对便宜，本方法选择甲醇-水（1090）作为流动相，在该流动相下，DON 的色谱图见图 2。图 2 DON 的色谱图Fig.2 Chromatogram of DON 流动相经优化后，以保留时间约 3 min 处计算，测 1 个样品消耗的甲醇量为 0.03 mL。目前国家标准和文献报道 12,20,24-29用液相色谱方法测 1 个样品至少需 0.3 mL 有机溶剂（见表 1） ，如国家标准 GB/T 23503-2009 中，测 1 个样品至少需 1.92 mL，与之相比，本方法的甲醇用量可节省 64 倍以上。2.2.2.4 方法的线性范围与检出限在
9、上述色谱条件下，对 0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 ng 的标准工作液进样分析，以 UPLC 测得的峰面积为纵坐标（y） ，相应的质量为横坐标（x）绘制标准曲线，结果表明，呕吐毒素在 0.510.0 4ng 范围内线性关系良好，线性方程为 y=909.5x+11268.36, 相关系数(R 2)为 0.99996。根据呕吐毒素检测产生的信噪比，得出方法的检出限（S/N=3）为 0.15 ng，定量下限（S/N=10）为 0.5 ng。目前文献报道普通 HPLC 的检出限为 0.756 ng (见表 2)，本方法的灵敏度比其他文献报道提高 5 倍以上。最新国家标准 GB/T 23503
10、-2009 给出的定量下限为 12.5 ng，与之比较，本方法的灵敏度提高 25 倍。灵敏度的提高，意味着用来进样分析的呕吐毒素量可以更少，在净化阶段能够使用柱容量更小的免疫亲和柱。传统 HPLC 方法，由于灵敏度相对较低，需要柱容量较高的免疫亲和柱，要求填充更多的 DON 抗体，增加了分析成本，本方法允许使用容量更低的免疫亲和柱，从而可以大大降低检测成本。考虑到不同厂家仪器差异和不同实验室的差异,确定检测限为 0.05mg/kg.2.2.2.5 方法的精密度与回收率将添加 DON 的小麦、玉米样品按照本方法进行检测，每个浓度做 3 个平行样，重复测 5 天，结果见表 2。从表中可见，本方法的
11、日内精密度为 2.9% 4.2%，日间精密度为 4.5%5.9%，具有较好的精密度。对加标样品（小麦和玉米加标浓度都分别为 0，0.5，1 和 5g.g -1）的考察结果显示，本方法的回收率为 86% 98%，优于国家标准和文献报道的回收率（ 70%110%） ，确定为80110%.表 1 不同样品中呕吐毒素的精密度和回收率Table 1. Recoveriess and RSDs of spiked samples with different DON concentrations Sample Spiked w(g.g -1)Average value w(g.g -1)Average r
12、ecovery R/%Intra-RSD sr/% Inter-RSD sr/%0 0 - - -0.5 0.44 88 4.2 5.81 0.84 84 3.8 5.1wheat5 4.72 94 3.0 4.70 0 - - -0.5 0.46 92 4.0 5.91 0.86 86 3.5 5.2corn5 4.91 98 2.9 4.52.2.2.6 实际样品的分析运用本方法对来自不同粮食产区的小麦样品进行了测试，结果表明，实际样品中的 DON 保留时间与标准品（见图 3A）的一致，本方法在实际样品检测中效果理想；小麦样品中通常均有一定的本底含量（见图 3B） ，而来自赤霉病高发区域的
13、小麦样品有污染（见图 3C） ，其 DON 含量为1.004 g/g。5图 3 呕吐毒素标准溶液（A） 、本底小麦样品（B）与污染小麦样品（ C）的色谱图Fig.3 Chromatograms of DON standard sample（A ）, background sample（B ） and contaminated sample（C ） of wheat 2.2.2.7 方法的验证本方法经北京市粮油食品检验所、黑龙江国家粮食质量监测中心、吉林国家粮食质量监测中心、河南国家粮食质量监测中心、湖南国家粮食质量监测中心、云南国家粮食质量监测中心、山东青岛国家粮食质量监测站、山东德州国家粮食
14、质量监测站、安徽国家粮食质量监测中心、江苏苏州国家粮食质量监测站等 10 家实验室验证。采用两种谷物及其制品（小麦、玉米）进行方法精密度实验。全部数据采用科克伦和格拉布斯（Grubbs）法检验，剔除离群值，根据情况处理歧离值后，计算谷物及其制品中脱氧雪腐镰刀烯醇的总体平均值（m ） ，重复性限（r）和再现性限（R） ，其中，小麦6中脱氧雪腐镰刀烯醇三个水平采取 10 家样品检测值进行统计，玉米样品中脱氧雪腐镰刀烯醇虽然在样品中的含量较高，但有两家的检测的质控控制较差，所以仅统计了 8 家实验室的数据，这些结果均符合食品法典委员会程序手册 （第二十版）中关于联合验证中 HorRat 在 2 之内
15、的规定。表 2 实验室间联合验证统计结果小麦 玉米参数水平 1 水平 2 水平 3 水平 1实验室数目 10 10 10 10参加统计实验室数目 10 10 10 8离群实验室数目 0 0 0 2平均值，m（mg/kg）0.28 1.00 1.74 1.36重复性标准偏差，Sr（mg/kg）0.012 0.021 0.029 0.02重复性限，r（mg/kg） 0.035 0.060 0.081 0.05再现性标准偏差，SR（mg/kg）0.018 0.171 0.138 0.09再现性限，R（mg/kg）0.154 0.484 0.392 0.26HorRat 值 0.34 1.08 0.5
16、4 0.45 3 采用国际标准和国外先进标准的情况，以及与国际、国外同类标准水平的对比，或者与测试的国外样品、样机的有关数据对比情况本方法的检出限为 0.15 ng，定量下限为 0.5 ng，精密度为 2.9%5.9%，回收率为84%98%，具有较高的精密度、回收率，其灵敏度也优于普通液相色谱法；有机溶剂用量少（每个样品消耗 0.03 mL 甲醇） ；从提取、净化到色谱分离，整个分析流程耗时不足 45 min。实际样品检测表明，本方法能够满足对样品快速、高通量、低溶剂的检测要求。表 3 本方法与其他液相色谱方法的性能比较Table 3 Comparison of the UPLC method
17、 and other HPLC methods reported recently in literature No. Matrix Extraction/clear-up Mobile phase/retention time Sensitivity m/ng RecoveryR/% Reference1 Grain Water with PEG /DON IAC0.1 mL/min CH3OH:H2O（1:9）/2.9 minLOD=0.15LOQ=0.58698-2 Infant Water with PEG 0.4mL/min LOD=1 7889 127cereal /DON IAC
18、 HCN:H2O（1:9）/7.94 min LOQ=23 Food Water with PEG /DON IAC0.8mL/min CH3OH:H2O（2:8）/12 minLOQ=12.570100204 Food Chloroform- Ethanol/ liquid-liquid extraction 0.5mL/min CH3OH:H2O（8:2）/ NoneLOD=4.2 7681 245 Wheat acetonitrile -water（85:15）/MFC1.0mL/min H2O: HCN:CH3OH（90:5:5）/6.9 minLOD 69296256 Wheat W
19、ater with PEG /DON IAC 0.6mL/min HCN:H2O（1:9）/5.3 minLOD 4.2 81100 267Cereal and cereal productsWater with PEG /DON IAC1.0mL/min H2O: CH3OH（85:15）/None LOD 0.754.57887278 Cereal grains Water with PEG /DON IAC1.0mL/min CH3OH:H2O（2:8）/5.867 minLOD=0.5LOQ=280110289Feed and raw materialsWater with PEG /
20、DON IAC1.0mL/min CH3OH:H2O（2:8）/6.91 minLOD=2.5LOQ= 8.584.097.2294 与有关的现行法律、法规和强制性国家标准、行业标准的关系本标准颁布实施后，针对粮食中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定，符合现行的法律法规和强制性（国家、行业、地方）标准要求。5 重大分歧意见的处理经过和依据无。6 按照标准化法的有关规定，提出强制性标准或推荐性标准的建议建议将本标准列为推荐性行业标准。 7 废止现行有关标准的建议无8 其他应予说明的事项标准采用了快速高效液相色谱仪Acquity UPLC（美国Waters公司） ，紫外检测器（PDA，美国Waters公司）
21、和岛津公司的快速高效液相色谱仪LC-30A二元高压梯度系统进行了适应性研究，方法在这两种仪器上结果符合要求。9 参考文献1 Zain M E. J. Saudi Chem. Soc., 2011, 15(2): 129-144.82 Gang Xie. Research on mycotoxins in contanminated grains D. Sichuan University, 2005 谢刚. 粮食污染主要真菌毒素的研究D. 四川大学, 2005.3 GB 2715-2005. Hygienic standard for grains. National Standards of
22、 the Peoples Republic of China (粮食卫生标准. 中华人民共和国国家标准 ).4 GB2761-2005. Maximum levels of mycotoxins in foods. National Standards of the Peoples Republic of China (食品中真菌毒素限量. 中华人民共和国国家标准).5 GB 2761-2011. National Food Safety Standards Maximum levels of mycotoxins in foods. National Standards of the Peo
23、ples Republic of China (食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量 中华人民共和国国家标准).6 Trucksess M W, Nesheim S, Eppley R M. J. Assoc. Off.Anal. Chem., 1984, 67(1): 40-43.7 Xu Y, Huang Z B, He Q H, Deng S Z, Li L S, Li Y P. Food Chem., 2010, 119(2): 834-839.8 Kolosova A Y, Sibanda L, Dumoulin F, Lewis J, Duveiller E, Van Petegh
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25、09.12 Dombrink-Kurtzman M A, Poling S M, Kendra D F. J. Food Protect., 2010, 73(6): 1073-1076.13 Antonios D, Guitton V, Darrozes S, Pallardy M, Azouri H. Food Addit. Contam.: B, 2010, 3(1): 45-51.14 Gupta V K, Chattopadhyay P, Kalita M C, Chaurasia A K, Gogoi H K, Singh L. Pharm. Methods, 2011, 2(1)
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28、ples Republic of China (配合饲料中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定 薄层色谱法. 中华人民共和国国家标准).20 GB/T 23503-2009. Determination of deoxynivalenol in food - High performance liquid chromatographic method with immunoaffinity column clean-up. National Standards of the Peoples Republic of China (食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定 免疫亲和层析净化高效液相色谱法中华人民共和国国
29、家标准).21 Novkov L, Matysov L, Solich P. Talanta, 2006, 68(3): 908-918.22 AlSayah M A, Rizos P, Antonucci V, Wu N. J. Sep. Sci., 2008, 31(12): 2167-2172.23 Fekete S, Fekete J, Ganzler K. J. Pharm. Biomed. Anal., 2009, 49(3): 833-838.24 Junshuang Wang, Dinghua Xu, Xiulan Sun. Sci. Tech Food Ind. 2008(2
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31、ton P, Damant A, Wood R. J. AOAC Int., 2005, 88(4): 1197-1204.28 Dan Mao, Yong Xu， Daoguang Zhang, Rong Zheng, Shen Jj, Ke Wang. Chin J Heal. Lab. Tech. 2007, 17(12): 2207-2208. 毛丹，许勇，张道广，郑荣，季申，王柯 . 中国卫生检验杂志, 2007, 17(12):2207-2208.29 Chunyan Zhang, Xiaozhi Zhou, Jufang Chen, Wenqin Zhang. Chin J. Anim. Sci. , 2010, 46(17)：67-69.张春艳，周孝治，陈菊芳，张文琴. 中国畜牧杂志, 2010, 46(17)：67-69.30 GB2761-2011食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量31 GB/T 5009.1-2003食品卫生检验方法 理化部分 总则32 粮食质量、原粮卫生和储粮安全检查办法( 国家粮食局 2006 年 7 月 25 日以国粮检2006117 号发布)
