1、ICS 点击此处添加中国标准文献分类号中 华 人 民 共 和 国 粮 食 行 业 标 准LS/T XXXXXXXXX粮油检测 粮食中赭曲霉毒素 A 的测定 超高效液相色谱方法Inspection of grain and oilsDetermination of Ochratoxin A in grains by ultra-high performance liquid chromatography 点击此处添加与国际标准一致性程度的标识（征求意见稿）XXXX - XX - XX 发布 XXXX - XX - XX 实施发 布XX/T XXXXXXXXX1前 言本标准按照 GB/T 1.12
2、009 给出的规则起草。本标准由国家粮食局提出。本标准由全国粮油标准化技术委员会（SAT/TC 270）归口。XX/T XXXXXXXXX2粮油检测 粮食中赭曲霉毒素 A 的测定 超高效液相色谱方法1 范围本标准规定了采用免疫亲和柱净化超高效液相色谱法测定谷物及其制品中赭曲霉毒素 A 的条件和详细分析步骤。本标准适用于小麦、玉米、稻谷、豆类及其制品中赭曲霉毒素 A 的测定。本标准方法赭曲霉毒素 A 的检出限为 0.5g/kg.2 原理试样经过甲醇-水溶液提取，提取液经过滤、稀释后，滤液经过含有赭曲霉毒素 A 特异抗体的免疫亲和柱层析净化，以酸化甲醇洗脱，洗脱液用带有荧光检测器的快速高效液相色谱
3、仪测定，外标法定量。3 试剂和材料除另有规定外，所用试剂均为分析纯，实验用水应符合 GB/T 6682 中一级用水要求。3.1 试剂3.1.1 甲醇：色谱纯。3.1.2 氯化钠，分析纯。3.1.3 磷酸氢二钠，分析纯。3.1.4 磷酸二氢钾，分析纯。3.1.5 氯化钾，分析纯。3.1.6 浓盐酸，分析纯。3.1.7 乙腈：色谱纯。3.1.8 乙酸，色谱纯。3.2 试剂配制3.2.1 提取液：乙腈+水（60+40），60份乙腈和40份水混合而成。3.2.2 洗脱液：酸化甲醇：1体积的色谱级乙酸和99体积的甲醇。3.2.3 真菌毒素清洗缓冲液：称取25.0 g氯化钠、5.0 g碳酸氢钠溶于水中，加
4、入0.1 mL吐温-20，用水稀释至1 L。3.2.4 磷酸盐缓冲液：8.0 g氯化钠、1.2 g磷酸氢钠、0.2 g磷酸二氢钾、0.2 g氯化钾溶解于约990 mL水中，用浓盐水调节pH至7.0，用水稀释至 1 L。3.2.5 碳酸氢钠溶液（10 g/L）：称取1g碳酸氢钠，用水溶解并稀释到100 mL。3.2.6 淋洗缓冲液：在100 mL磷酸盐缓冲液中加入1.0 mL吐温-20。3.3 标准品赭曲霉毒素 A 标准品：纯度 99%；或有证溶液标准物质。3.4 标准溶液配制XX/T XXXXXXXXX33.4.1 赭曲霉毒素 A 标准储备溶液使用有证溶液标准物质；或准确称取适量的赭曲霉毒素
5、A 标准品（3.3.1） ，用甲醇（3.1.1）配制100 g/ L 的赭曲霉毒素 A 标准储备液，保存于 4冰箱备用。3.4.2 赭曲霉毒素 A 标准工作溶液准确移取适量的赭曲霉毒素 A 标准储备液（3.4.1） ，用流动相稀释成标准工作溶液，浓度为1g/L、2g/L、5 g/ L、10 g/ L、20g/ L、50g/ L。3.5 材料3.5.1 赭曲霉毒素 A 免疫亲和柱3.5.2 定性滤纸：12 cm Whatman 4 号 1，或相当者3.5.3 玻璃纤维滤纸：9 cm Whatman GF/A，或相当者3.5.4 微孔滤膜：0.22m，有机系3.5.5 注射器：10 mL 和 20
6、mL4 仪器和设备4.1 快速高效液相色谱仪：带荧光检测器和数据处理系统4.2 谷物粉碎机4.3 高速均质器：18 000 r/min 22 000 r/min，或相当的设备4.4 空气压力泵4.5 天平：感量 0.01 mg4.6 多功能振荡器4.7 泵流操作架4.8 离心机5 分析步骤5.1 试样制备将大于 1kg 样品用谷物粉碎机磨细至粒度小于 1 mm，混匀二次取样，将试样装入洁净的容器内，密封，标明标记，置于 4下避光保存。用于检测。5.2 测定步骤5.2.1 提取称取 25 g 试样(m，精确到 1 mg)，加入 100.0 mL 乙腈+水（60+40）溶液(3.2.3) ，振荡
7、30 min（振荡频率 120rpm）或高速均质 3 min，槽纹折叠滤纸（3.5.2 ）过滤或转移 25ml 的提取液于 50ml 的离心管中，5000r/min，离心 5min。取 4.0 mL 滤液加入 26.0 mL 磷酸盐缓冲液（3.2.6）混合均匀，混匀后高速离心机（4.4）离心 5 min（转速 8000 rpm） ，上清作为滤液备用。1) 1 Whatman 4 号为适合的市售产品的实例。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示本标准对该产品的认可。如果其他产品具有相同的效果，可经实验评估后使用这些等效的产品，下同。XX/T XXXXXXXXX45.2.2 净化 将免疫亲
8、和柱连接于玻璃注射器（4.5）下，将上述30ml的滤液全部注入玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器相连接，调节压力，使溶液以约1 滴/S 的流速通过免疫亲和柱，直至空气进入亲和柱中，依次用10 mL 真菌毒素清洗缓冲液（3.2.4）、10 mL水先后淋洗免疫亲和柱，流速约为1 滴/S2 滴/S，弃去全部流出液，抽干小柱。准确加入1.5 mL酸化甲醇或免疫亲和柱厂家推荐的洗脱液进行洗脱，流速约为1 滴/S ，收集全部洗脱液于干净的玻璃试管中，在45下以氮吹仪用氮气吹干。用液相流动相溶解残渣并定溶到500 L，即为试样提取净化液，供高效液相色谱测定时使用。*注：由于不同厂商提供的亲和柱操作程序可
9、能有所不同，实际操作时，也可参照免疫亲和柱厂商提供的操作说明和程序使用。5.3 测定条件5.3.1 仪器参考条件色谱柱：C 18 柱,100 mm3 mm，1.7m,或相当者；柱温：35；流动相：乙腈+水+ 冰乙酸（96+102+2） ；流速：0.3 mL/min。进样量：10 L。荧光检测器：激发波长 310 nm，发射波长 465 nm。5.3.2 标准曲线的制作在上述色谱条件下，等基线平稳后进样分析。用进样器吸取 10 L 赭曲霉毒素 A 标准工作溶液（3.4.2）注入高效液相色谱仪进行分析，得到赭曲霉毒素 A 标准溶液快速高效液相色谱图。参考谱图见附录 A。以赭曲霉毒素 A 标准工作液
10、浓度为横坐标，相对应色谱峰峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。5.3.3 试样溶液的测定用进样器吸取 10 L 样液注入快速高效液相色谱仪进行分析。比较样品与标准的色谱图，根据保留时间定性。根据样品色谱图中赭曲霉毒素 A 的峰面积用标准曲线定量，得到试样液中赭曲霉毒素 A的浓度 。用进样器吸取 2L 流动相，按前步骤得出空白试样的浓度为 。1c 0c5.4 平行试验按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。6 结果计算XX/T XXXXXXXXX5样品中赭曲霉毒素 A 的含量按式、计算：WVcX)(01其中：4321Vm式中：X1 样品中赭曲霉毒素 A 的含量，g/kg ； 试样液中赭曲霉毒素 A
11、 的含量，g/L；c 空白试验赭曲霉毒素 A 的含量，g/L ；0V 最终甲醇洗脱液体积，mL；W 最终净化洗脱液所含的试样质量， g；m 试样称取的质量，g；V1 样品提取液总体积， mL；V2 移取样品滤液的体积， mL；V3 用于稀释滤液的缓冲液体积， mL；V4 通过免疫亲和柱的稀释后样品提取液体积， mL。计算结果表示到小数点后 2 位。7 精密度在重复性条件下获得的两次独立实验结果的绝对差值不大于其算术平均值的 15%。8 其它本标准方法赭曲霉毒素 A 的检出限为 0.5g/kg，定量限为 1g/kg，回收率为 80%110%。XX/T XXXXXXXXX6附录 A赭曲霉毒素 A 液相色谱图图 1 赭曲霉毒素 A 标准品的液相色谱图
