1、2 纯培养技术和显微技术2.1 纯培养技术 一. 无菌技术 二. 用固体培养基分离纯培养三. 用液体培养基分离纯培养 四. 单细胞（孢子）分离 五. 选择培养分离 六. 二元培养物 七. 微生物的保藏技术 2.2 显微技术 一. 显微镜种类及其原理 二. 显微观察样品的制备 微生物的基本特点：小！在绝大多数情况下都是利用微生物的群体来研究其属性；微生物的物种（菌株）一般也是以群体的形式进行繁衍、保存；培养技术在微生物学中具有重要意义！在研究中所使用的微生物培养群体：培养物：在一定的条件下培养、繁殖得到的微生物群体混合培养物：含有多种微生物的培养物；纯培养物：只有一种微生物的培养物；只有纯培养物
2、才能提供单一微生物种的性状,纯培养技术是进行微生物学研究的基础！保证纯培养的无菌技术是保证微生物学研究正常进行的关键！微生物的基本特点：小！决定了显微技术是进行微生物研究的另一项重要技术，因为绝大多数微生物的个体形态及其内部结构只能通过显微镜才能进行观察和研究。2.1 纯培养技术一. 无菌技术 在分离、转接及培养纯培养物时防止其被其他微生物污染的技术被称为无菌技术 灭菌： 用于分离、培养微生物的器具事先不含任何微生物； 无菌操作：在转接、培养微生物时防止其它微生物的污染；1、微生物培养的常用器具及其灭菌常用的器具：试管、瓶子、培养皿等常用的灭菌方法：高压蒸汽灭菌 115 30 min，121
3、20 min; 高温干热灭菌 160 2 h，140 4h；过滤除菌。2、无菌操作 火焰附近（酒精灯、煤气灯）进行；在无菌箱或操作室内无菌的环境下进行二. 用固体培养基分离纯培养几个基本概念:菌落（colony）:单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体。菌苔（lawn）:当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成菌苔。平板，即培养平板（culture plate）：指固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛固体培养基的平皿。 不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征（形状、颜色等） ，可以成为对该微生物进
4、行分类、鉴定的重要依据。同一细菌在不同的培养平板上形成不同的特征菌落培养基：液体培养基；固体培养基；半固体培养基1. 稀释倒平板法（pour plate method）2. 涂布平板法（spread plate method） 3. 平板划线法（streak plate method） 4. 厌氧微生物的分离纯培养: 稀释摇管法（dilution shake culture method）; 自制简易装置; 厌氧罐; 厌氧手套箱三. 用液体培养基分离纯培养顺序稀释，高度稀释，使一支试管中分配不到一个微生物。采用稀释法进行液体分离，必须在同一个稀释度的许多平行试管中，大多数（一般应超过 95%）
5、表现为不生长。 分离出混杂微生物群体中占数量优势的种类 四. 单细胞（孢子）分离用显微操作仪，在显微镜下进行。难度与细胞或个体的大小成反比，限于高度专业化的科学研究中采用。 五. 选择培养分离没有一种培养基或一种培养条件能够满足自然界中一切生物生长的要求，在一定程度上所有的培养基都是选择性的。 自然样品中，某一种微生物所存在的数量与其它微生物相比非常少时，单采用一般的平板稀释方法几乎是不可能分离到该种微生物的。 例:若某处的土壤中的微生物数量在 108 时，必须稀释到 10-6 才有可能在平板上分离到单菌落，而如果所需的微生物的数量仅为 1023，显然不可能在一般通用的平板上得到该微生物的单菌
6、落。 选择平板：抑制使大多数微生物不能生长，或具区别特征的直观结果。 富集培养：造成有利于某种菌生长的环境1. 利用选择平板进行直接分离高温下培养：分离嗜热细菌；培养基中不含 N：分离固氮菌；培养基加抗生素：分离抗性菌；待分离的微生物生长，其它微生物的生长被抑制牛奶平板：分离蛋白酶产生菌；待分离的微生物的生长特征明显不同于其它微生物(X-gal，5-溴-4-氯-3- 吲哚-半乳糖苷,蓝白斑)2. 富集培养利用不同微生物间生命活动特点的不同，制定特定的环境条件，使仅适应于该条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加，人们能够更容易地从自然界中分离到所需的特定微生物。 六. 二元培养物
7、培养物中只含有二种微生物，而且是有意识的保持二者之间的特定关系的培养物称为二元培养物。病毒和宿主细胞；寄生细菌和细菌; 纤毛虫、变形虫或细菌菌体细胞和粘细菌；七. 微生物的保藏技术性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。影响微生物菌种稳定性的因素：a）变异 b）污染 c）死亡 基本要求：在一定时间内使菌种不死、不变、不乱。基本方法：生活态: 培养基传代培养 (斜面、平板、半固体); 寄主传代培养休眠态 冷冻(液氮、低温冰箱); 干燥(沙土管、冷冻真空干燥)其它方法：滤纸片;明胶片;蒸馏水对于一些比较重要的微生物菌株，则要尽可能多的采用各种不同的手段进行保藏，
8、以免因某种方法的失败而导致菌种的丧失。2.2 显微技术一. 显微镜种类及其原理1. 普通光学显微镜 (light microscope)简单显微镜; 复式显微镜,1) 物镜0.5 分辨率（最小可分辨距离）= n sin 数值孔径值（Numerical Aperture ，NA）: n sin n：玻片与物镜间介质的折射率:为物镜镜口角的半数，它取决于物镜的直径和工作距离用香柏油取代空气的作用：介质折射率提高, 数值孔径值和分辨率均得到提高; 香柏油与玻璃的折射率相近, 很多原来由于在透镜及载片表面的反射和折射而损失的光线可以进入物镜，使照明亮度提高，改善观察效果。人眼的分辨能力在 0.2 mm
9、 左右，因此光学显微镜的最大有效放大倍数（使用油镜）是 1,000到1,500。2) 目镜目镜的作用只是将物镜放大的实象进一步放大形成能见的虚象,目镜不可以提高分辨率光学显微镜一般配置的最大放大倍数：目镜：10 15 ；物镜： 100 ；总放大倍数 10001500 ；2. 暗视野显微镜 (dark-field microscope)普通光学显微镜又称明视野显微镜,其照明光线直接进入视野，属透射照明。生活的细菌在明视野显微镜下观察是透明的，不易看清。 暗视野显微镜则利用特殊的聚光器实现斜射照明，给样品照明的光不直接穿过物镜，而是由样品反射或折射后再进入物镜，因此，整个视野是暗的，而样品是明亮的
10、。反差增大,观察微粒的尺寸小于显微镜的分辨率 . 3. 相差显微镜(phase-contrast microscope)相差显微镜配备有特殊的光学装置环状光阑和相差板，利用光的干涉现象，能将光的相位差转变为人眼可以察觉的振幅差（明暗差） ，从而使原来透明的物体表现出明显的明暗差异，对比度增强。4 荧光显微镜(fluorescent microscope)5.透射电子显微镜 6.扫描电子显微镜 与光学显微镜差异：1） 电子波(波长最短可达到 0.005 nm)代替光源 2）电镜镜筒中要求高真空（在电子的运行中如遇到游离的气体分子会因碰撞而发生偏转，导致物象散乱不清）3）用电磁圈来使 “光线” 汇
11、聚、聚焦4）电子像人肉眼看不到，需用荧光屏来显示或感光胶片作记录。 透射电子显微镜(transmission electron microscope): 电子束穿过薄切片扫描电子显微镜(scanning electron microscope): 观察样品的表面结构 7.扫描隧道显微镜(Scanning Tunneling Microscope，STM ) 是目前分辨率最高的显微镜. STM 的横向分辨率可以达到 0.1-0.2 nm，纵向分辨率可以达到0.001 nm，足以 对单个的原子进行观察 。 可以避免样品的变形. 由于 STM 在扫描时不接触样品，又没有高能电子束轰击 它不仅可以在真
12、空，而且可以在保持样品生理条件的大气及液体环境下工作。STM 对生命科学研究领域具有十分重要的意义。 二. 显微观察样品的制备分辨率: 能辨别两点之间最小距离的能力放大: 放大倍数反差: 被观察物区别于背景的程度样品制备是显微技术的一个重要环节，直接影响着显微观察效果的好坏。通过各种手段提高其反差。 光学显微镜的制样（讲课内容）电子显微镜的制样（略）活体观察: 压滴法；悬滴法；菌丝埋片法；小培养法染色观察 细菌菌体(等电点一般 pH 2-5)在中性碱性 或弱酸性溶液中带负电荷,易于碱性染料(正电荷) 进行结合,所以常用碱性染料进行染色.如果用酸性染料,染液的 pH 必须低于菌体的等电点 ,使菌体带有负电荷。常见碱性染料:结晶紫，番红，美蓝，孔雀绿；中性红等。常见酸性染料:刚果红，伊红，品红，藻红等。染色操作程序制片干燥固定染色水洗干燥镜检革兰氏染色（C.Gram 于 1884 年发明的一种鉴别不同类型细菌的染色方法。 ）结晶紫初染 碘液媒染 酒精脱色番红复染
