1、下面内容综合了 Agilent 和网上查到的一些资料：一般来说，反相 HPLC 的流动相包括有机相和水相，有机相常用的为色谱甲醇和乙腈，不太常用的还有四氢呋喃和异丙醇。甲醇有其性价比的优势，但是甲醇活性高，可能与某些样品发生反应，而且甲醇在低波长下有紫外吸收，会降低分析方法的灵敏度；乙腈虽然价格很高，毒性比甲醇大，但是洗脱能力比甲醇强，很少与样品发生反应，用作流动相系统压力要比甲醇低很多，且截止波长比甲醇低 20nm，增加了检测出在低波长下才有吸收的杂质的可能性，所以我们一般倾向于多用乙腈，少用甲醇。但是当样品峰形不好或者分离不好时，更换溶剂是一个很好的选择，因为不同的溶剂可提供不同的选择性。
2、在反相色谱中，流动相中水相的 pH 和离子强度在开发对条件微小变化不敏感的耐用方法中非常重要。对于离子型化合物，典型样品的保留随 pH 改变而明显变化，因此控制 pH 对于保留和选择性的稳定非常重要，通常在 pH24 的条件下，保留时间对 pH 的微小改变稳定性最高，因此建议将这一 pH 范围作为大多数样品方法开发的起始 pH，包括碱性化合物和一般的弱酸。考虑到重现性，所用的 pH 应高于或低于待分析物 pKa 或 pKb 上下一个 pH 单位。当待分析物 pKa或 pKb 未知时，应测试一种以上流动相 pH（如 pH2.0 和 pH6.5 缓冲盐溶液） ，可提供最好结果。对流动相的优化主要体
3、现在水相上。流动相 pH 值对色谱分离的影响有多钟方式，根据待分析物的结构性质，pH 可能影响选择性、峰形和保留。如果是非极性较强或中性的化合物，pH 对分离度和保留的影响一般不明显。如果是可离子化的化合物，如酸或碱，保留因子和选择性随 pH 改变非常明显。（1） 酸性分析物，应选择低 pH 缓冲液流动相，以防止分析物离子化。了解分析物的 pKa，才能有效的选择流动相 pH。缓冲范围应在其缓冲液离子 pK 值1 pH 单位，使流动相的优化具有一定的灵活性。例如，醋酸盐的 pKa 为4.8，缓冲范围为 pH3.85.8。（2） 碱性化合物，在高 pH 条件下才能得到其非离子形态，但这对色谱柱不利
4、。通常许多碱性化合物在低 pH 条件的保留就已经满足要求了，所以可选择低 pH 条件。如果选择高 pH 条件，则注意需选择耐强碱的色谱柱。水里可以加酸、加碱、加盐，从而改变 pH 值、改善峰形、提高分离度。常用的酸有磷酸、三氟乙酸、甲酸、乙酸、高氯酸、甲基磺酸等。单纯做液相时，低波长下磷酸最合适；而做液质时首选三氟乙酸，或甲酸、乙酸。开发液相分析方法时流动相可首选 0.1%的磷酸水溶液，然后再以此为基础做优化。在单独用酸不行的时候再考虑使用缓冲盐，缓冲盐的选择原则是：简单、稳定、缓冲能力强、配制简单，需要调 pH 值时要有相应的酸或碱。常用的缓冲盐是磷酸盐，主要是钾盐和钠盐，还有醋酸盐，常用的
5、盐浓度在 1020mM 左右（根据实际情况，有时可以选择更低或更高浓度，建议最高浓度不超过 50mM） 。下表是 Waters 提供的一个资料，常规实验室建议使用的缓冲盐体系。缓冲盐/流动相 pKa 缓冲范围挥发是否MS 兼 备注改性剂 性？(1 pH)容？TFA 0.3 - 是 是离子对试剂，能够抑制MS 信号，通常使用的浓度范围 0.020.1%乙酸 4.76 - 是 是同乙酸铵一起使用具有最大的缓冲能力，通常使用的浓度范围0.11.0%甲酸 3.75 - 是 是同甲酸铵一起使用具有最大的缓冲能力，通常使用的浓度范围0.11.0%乙酸盐（铵盐） 4.76 3.765.76 是 是通常使用
6、110mM 浓度，注意钾盐和钠盐是非挥发性的甲酸盐（铵盐） 3.75 2.754.75 是 是通常使用 110mM 浓度，注意钾盐和钠盐是非挥发性的磷酸盐1 2.15 1.153.15否 否 传统的低 pH 缓冲体系，UV 透光度很好磷酸盐2 7.2 6.28.2否 否当 pH 超过 7 时，降低操作温度/缓冲盐浓度以及使用保护柱可以延长色谱柱寿命磷酸盐 12.3 11.313.3 否 否 当 pH 超过 8 时，降低操3 作温度/缓冲盐浓度以及使用保护柱可以延长色谱柱寿命4-甲基吗啡啉 8.4 7.49.4 是 是通常使用浓度为 10mM或更少氨水碳酸氢铵9.210.3(HCO3-)9.2(
7、NH4+)8.210.28.211.3是 是通常使用浓度为510mM（用于 MS 工作时保持离子源温度超过150）。用氨水或乙酸调节 pH 值，在 pH10 时具有很好的缓冲能力。乙酸铵 9.2 8.210.2 是 是 通常使用浓度为110mM甲酸铵 9.2 8.210.2 是 是 通常使用浓度为110mM硼酸 9.2 8.210.2 否 否降低温度，减少浓度并使用色谱柱来延长柱寿命CAPSO（3-环己胺基-2-羟基丙磺酸9.7 8.710.7 否 否两性离子缓冲液，同乙腈互溶，通常使用浓度为 110mM，气味小Glycine甘氨酸 2.4,9.8 8.810.8 否 否两性离子缓冲液，比使用硼酸盐对柱子的损伤更小些1-甲基 10.2 9.311.3 是 是 通常使用浓度为哌啶 110mMCAPS 10.4 9.511.5 否 否两性离子缓冲液，同乙腈互溶，通常使用浓度为 110mM，气味小三乙胺（乙酸盐）10.7 9.711.7 是 是通常使用浓度为0.11.0%。当使用乙酸滴定时形成可挥发性的缓冲液（不可用盐酸或磷酸）。作为离子对试剂用于 pH79 条件下的DNA 分析吡咯烷 11.3 10.312.3 是 是 温和的高 pH 缓冲液体现，柱寿命较长
