1、常用血清学检测方法介绍一、酶联免疫吸附试验诊断技术目前，该项技术已在兽医学上得到广泛的应用，大多数动物传染病都已经研制成 ELISA 检测方法。1、酶联免疫吸附试验的原理ELISA 的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物
2、后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。2、ELISA 的类型根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。用于动物疫病检测的 ELISA 主要有以下几种类型：.双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法。在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质、微生物病原体第二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。例如猪瘟病毒检测ELISA、禽流感病毒抗原捕获 ELISA，就是
3、根据这种原理设计的。.双抗原夹心法测抗体反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。乙肝 HBs 的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，需要根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于于间接法。此外，该方法不受被检动物种属差异的限制。.间接法测抗体间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗体（抗免疫球蛋白抗体） ，检测与固相抗原结合的受检抗体（见图1） 。操作步骤如下：（1）将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗
4、原及杂质。（2）加稀释的受检血清，保温反应。血清中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体，血清中的其他成份在洗涤过程中被洗去。（ 3） 加 酶 标 抗 抗 体 可 用 酶 标 抗 人 Ig 以 检 测 总 抗 体 ， 但 一 般 多 用 酶 标抗 人 IgG 检 测 IgG 抗 体 。 固 相 免 疫 复 合 物 中 的 抗 体 与 酶 标 抗 体 抗 体 结 合 ， 从而 间 接 地 标 记 上 酶 。 洗 涤 后 ， 固 相 载 体 上 的 酶 量 与 标 本 中 受 检 抗 体 的 量 正 相关 。（4）加底物显色本法主要用于对病原体抗体的
5、检测而进行传染病的诊断。间接法的优点是变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。间接法在动物疫病抗体检测中应用广泛，例如禽流感的间接 ELISA，用禽流感病毒 NP 蛋白包被成抗原板，待检血清中的抗体与之结合，再加酶标二抗反应，可以检测所有 A 型禽流感病毒抗体。.竞争法测抗体当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争固相抗原。标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。.竞争法测抗原小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测
6、定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和固相抗原共同竞争一定量的酶标抗体。标本中抗原量含量愈多，结合到固相上的酶标抗体愈少，最后的显色也愈浅。小分子激素、药物等 ELISA 测定多用此法。例如，猪瘦肉精的检测，多用瘦肉精抗原包被反应板，让样品中的瘦肉精抗原和板上的抗原共同竞争酶标单克隆抗体。目前，已有商品化、标准化的试剂盒，可检测猪瘟、猪伪狂犬、猪蓝耳病、猪乙型脑炎、猪细小病毒、猪圆环病毒、猪弓形虫、猪喘气病等各种抗体。（二）琼脂扩散试验1、基本概念沉淀反应：是利用可溶性抗原与抗体结合，形成肉眼可见的沉淀的一类血清学免疫反应 。抗原可以是多糖、蛋白质、类脂等。如细菌内毒素、外毒素、菌体裂
7、解物，病毒悬液、病毒的可溶性抗原、血清、组织浸出液等。沉淀试验包括絮状沉淀试验、琼脂扩散试验、免疫电泳。琼脂扩散试验：是一种运用沉淀反应原理进行兽医诊断检测的一种常规实验方法。2、基本原理琼脂扩散试验是利用抗原抗体能在琼脂凝胶中自由扩散，并在琼脂中结合，在一定比例处凝聚形成沉淀线，从而对抗原或抗体进行的测定、比较、鉴定和检测。该方法具有简便易行的特点，不需使用大量昂贵仪器设备，易于操作而被广泛采用。琼脂扩散试验分为四种类型：单向单扩散、单向双扩散、双向单扩散、双向双扩散。其中应用最广的是双向单扩散和双向双扩散，双向单扩散主要用于对抗原抗体的定量测定，双向双扩散主要用于对抗原的比较，以及抗原抗体
8、的检测。双向双扩散简称双扩散，即抗原抗体在琼脂中相互扩散，各自产生一个扩大的环，两环相遇时，在比例适当处，产生一条致密的白色沉淀线。这条沉淀线同时能阻止相同的抗原、抗体成分的继续扩散。根据所用试剂及检测对象的不同，双扩散又分为两类，一类利用已知抗原检测抗体，即血清流行病学调查，如禽流感、蓝舌病、口蹄疫、牛白血病、马传贫、非洲马瘟、禽霍乱等，另一类是利用己知抗体检测抗原，如马立克羽髓抗原的检测。（三） 凝集试验凝集试验是颗粒性抗原（如细菌、红细胞等）或表面载有抗原的颗粒状物质（如聚苯乙烯胶乳、红细胞、碳素颗粒等） ，与相应抗体在电解质存在下，结合出现肉眼可见的凝集（agglutination ）
9、现象的试验。凝集试验是一个定性的检测方法，即根据凝集现象的出现与否判定结果阳性或阴性；也可以进行半定量检测，即将标本作一系列对倍稀释后进行反应，以出现阳性反应的最高稀释度作为滴度。由于凝集反应方法简便，敏感度高，迄今已成为通用的免疫学试验，广泛应用于临床检验。凝集反应可分为直接凝集反应和间接凝集反应两大类。间接凝集试验中的间接血凝试验和乳胶凝集试验应用最为广泛。1、直接凝集反应细菌、螺旋体和红细胞等颗粒抗原，在适当电解质参与下可直接与相应抗体结合出现凝集，称为直接凝集反应（direct agglutination） 。凝集反应中的抗原称为凝集原（agglutinogen ） ，抗体称为凝集素（
10、agglutinin） 。直接凝集试验可分为玻片法、平板法、试管法及微量凝集法等。2、间接凝集反应将可溶性抗原(或抗体)先吸附于适当大小的颗粒性载体的表面，然后与相应抗体 (或抗原)作用，在适宜的电解质存在的条件下，出现特异性凝集现象，称间接凝集反应(indirectagglutination)或被动凝集反应（passiveagglutination） 。这种反应适用于各种抗体和可溶性抗原的检测，其敏感度高于沉淀反应，因此被广泛应用于临床检验。在间接凝集反应中，可用作载体的颗粒种类很多，常用的有动物或人红细胞、细菌和多种惰性颗粒如聚苯乙烯胶乳(polystyrenelatex） 、活性炭、皂土
11、（bentonite） 、脂质体等，根据所用载体不同，间接凝集试验又可称为间接血凝试验、胶乳凝集试验、炭凝集试验、皂土凝集试验、脂质体凝集试验等。间接凝集反应具有快速、敏感、操作简便、无需特殊的实验设备等特点，而且能用于抗原或抗体的测定，因此在临床检验中广为应用。下面重点介绍最常用的间接血凝试验和胶乳凝集试验。 间接血凝试验以红细胞作为可溶性抗原的载体来检测抗体，称为间接血凝试验（IHA） ，也称被动血凝试验（PHA） 。如将抗体吸附（致敏）在红细胞上用于检测抗原，则成为反向间接血凝试验。该方法具有许多优点：如敏感性高，特异性强，重复性和稳定性好，操作简便，反应迅速，即可以定性又可以半定量，而
12、且试剂价格低廉，不需要特殊复杂的仪器设备等。但是红细胞凝集易受到如红细胞的来源，致敏条件和操作技术等多种因素的影响，同时标本中的杂质、细菌污染和类属抗原等又常引起非特异性凝集反应，因此，试验时必须精心操作，注意防止污染，并设置相应对照。间接血凝试验在临床检验中应用广泛，可用于口蹄疫、猪瘟以及弓形体病等病的抗体的检测。反向间接血凝试验还可应用于口蹄疫病毒的检测和定型以及水疱病病毒抗原、猪传染性胃肠炎病毒抗原和小鹅瘟病毒抗原等的检测。 胶乳凝集试验胶乳凝集试验也是一种间接凝集试验，所用的载体颗粒为聚苯乙烯胶乳，是一种直径约为0.8m 大小的圆形颗粒，带有负电荷，可物理性吸附蛋白分子，但这种结合牢固
13、性差。也可制备成具有化学活性基团的颗粒，如带有羧基的羧化聚苯乙烯胶乳等，抗原或抗体以共价键交联在胶乳表面。化学交联一般通过缩合剂碳化二亚胺将胶乳上的羧基与被交联物上的氨基缩合在一起。这种用交联致敏的胶乳试剂性能稳定，保存期长。胶乳凝集试验分试管法与玻片法。试管法先将受检标本在试管中以缓冲液作倍比稀释，然后加入致敏的胶乳试剂，反应后观察胶乳凝集结果。玻片法操作简便，一滴受检标本和一滴致敏的胶乳试剂在玻片上混匀后，连续摇动23min 即可观察结果。出现凝集大颗粒的为阳性反应，保持均匀乳液状为阴性反应。胶乳为人工合成的载体，因此其性能比生物来源的红细胞稳定，均一性好。但胶乳与蛋白质的结合能力以及凝集性能不如红细胞，因此作为间接凝集试验，胶乳试验的敏感度不及血凝试验。胶乳凝集试验可用于猪伪狂犬病、细小病毒病以及乙型脑炎等病的检测
