1、 RNA 甲基化修饰（ 1） m6A 概念 | 重磅前沿 已知 RNA 存在超过 100 种修饰。在真核生物中， 5 端的 Cap 以及 3 的 ployA 修饰在转录调控中起到了十分重要的作用，而 mRNA 的内部修饰则用于维持 mRNA 的稳定性。mRNA 最常见的内部修饰包括 N6-腺苷酸甲基化（ m6A）、 N1-腺苷酸甲基化（ m1A）、胞嘧啶羟基化（ m5C）等。 对于大热的 m6A，截至 2017 年，全球的科学家已经鉴定了参与 m6A 的许多酶，包括去甲基化酶、甲基化酶和甲基化识别酶等。芝加哥大学的何川教授对此贡献巨大。来自中科院北京基因组研究所的杨运桂研究员也是这方面的大牛。
2、 一旦参与 m6A 修饰的酶出现异常将会引起一系列疾病，包括肿瘤、神经性疾病、胚胎发育迟缓等。此外，一些非编码 RNA 如 lncRNA、 tRNA、 rRNA 以及剪切体 RNA 在转录前后，也存在大量的碱基修饰活动。虽然近几年，关于 RNA 修饰的研究数量开始增多并慢慢成形，一些深入性的机制研究仍有大量的工作待 全球的科学家去完成。但是无论如何，coding RNAs 和 non-coding RNAs 上发生的动态修饰代表了一种全新的遗传信息调控方式。 早在上世纪 60 年代，除了传统的 ACGU 四种碱基外， Cohn 等人已经在 RNA 上发现了大量的碱基位点修饰。 Holley 等
3、人于 1965 年，首次在酵母的 tRNA 中鉴定了包括假尿苷（ pseudouridine）在内的十余种不同的 RNA 修饰。 已知绝大部分真核生物中， mRNA在 5 Cap 处存在甲基化修饰，作用包括维持 mRNA 稳定性、 mRNA 前体剪切、多腺苷酸化、 mRNA 运输与翻译起 始等。而 3 polyA 发生的修饰有助于出核转运、翻译起始以及与 polyA 结合蛋白一起维持 mRNA 的结构稳定。 图 1 真核生物 mRNA 上存在的各种碱基修饰行为，在 5 和 3 的 UTR 以及中间的coding region 都有碱基发生修饰。 Roundtree et al (2017) C
4、ell, 169 15: 1187-1200 但是这些修饰只发生 mRNA 的头部和尾部，关于 RNA 的内部修饰（ internal modification）在许多种类的 RNA 中都有发生。无论是 mRNA 还是 lncRNA，都大量存在 m6A 修饰。 m6A 能够加速 mRNA 前体的加工时间，加快 mRNA 在细胞中的转运速度和出核速度。 除了 m6A， RNA 上还存在以下常见的几种修饰，包括 m1A， m5C 等（图 1）。 已知 tRNA 上发生碱基修饰的比例较高，会有各种各样的碱基修饰行为。 tRNA 修饰有助于提高翻译效率，维持其三叶草折叠二级结构的稳定性。 人类的核糖体
5、 RNA（ rRNA）上有超过 200 个碱基修饰位点，而剪切体 RNA（ spliceosomal RNA）上 也有超过 50 个碱基修饰位点。 虽然 RNA 甲基化的研究在上世纪七十年代就开始，但是由于技术上的局限一直停滞不前。直到最近几年在何川教授等研究团队的带领下，通过不断的技术创新和难点攻克，m6A 等甲基化修饰的研究才不断取得突破性的进展。 随着分析化学工具的升级以及高通量测序技术的兴起，研究 RNA 修饰的方法变得越来越便捷。强大的工具是研究工作的前提保证。伴随 NGS 的发展，表观转录组学诞生了，其中大热的主角就是腺苷酸甲基化，包括 m6A 和 m1A 等。那么下面我们就要来讲
6、一讲这期的主角 m6A。 图 2 N6-甲基化 腺苷酸结构示意图 Roundtree et al (2017) Cell, 169 15: 1187-1200 我们先来了解下什么叫 m6A 修饰。从图 2 中我们可以看到，这是一个已经发生甲基化的核糖核苷酸，确切地说叫 N6-methyladenosine。一共分为 2 个大的结构。我们先来回顾下基础生物化学知识。左下角的是五碳糖，图 2 中 a 框部分也就是五碳糖的第二位 C 处的羟基发生脱氧就会变成脱氧核糖核苷酸（从 RNA 变成 DNA）。图 2 中 c 框部分标注的，也就是第四位的 C 处通常会带有磷酸基，如果此处带有 2 个磷酸基团那
7、么就 叫 ADP，如果带有 3 个磷酸基团那就是大名鼎鼎的 ATP 了。 图 2 中 b 框部分通常就是我们所说的含氮碱基。这里特指腺苷酸（ A），当腺苷酸的第六位 N 处发生甲基化时，就是我们所说的m6A。 图 3 （左）腺苷酸甲基化和去甲基化的过程（ Roundtree et al (2017) Cell, 169: 1187）； （右） m6A 甲基化酶 consensus motif（ Fu, Y et al (2014) Nature Reviews Genetics, 15(5): 293） 从图 3 左中我们可以看到，当从 DNARNA 过程中，腺苷酸在甲基化酶 METTL3、M
8、ETTL14 和 WTAP 等作用下在第六位 N 发生了甲基化修饰。这类酶我们称之为Writers，其中 METTL3 和 METTL14 形成杂络物（ hetero complex），与 WTAP（也叫做 Fl(2)d）及其他 factors 如 KIAA1429（也叫做 Virilizer）一起对腺苷酸进行修饰。另外Writers 酶还包括酿酒酵母中的 Ime4 等。 接下来这些已经发生 m6A 修饰的碱基，在 FTO 和 ALKBH 这两种酶的作用下发生去甲基化 , 这类酶我们称之为 Erasers。其中 FTO 就是臭名昭著的 Fat mass and obesity-associat
9、ed protein，其详细的分子机制在 2007 年的小鼠模型上做过比较系统的研究。该酶与 ALKBH5 一起，使得 RNA 甲基化成为一种可逆的反应。 最后这些发生甲基化修饰的 RNA 碱基位点，需要特定的酶来识别。这时候就需要咱们的Readers 登场了。已知 YTHDF 家族包括 YTHDF1、 YTHDF2、 YTHDF3 以及酿酒酵母中的 Mrb1 基因、粟酒裂殖酵母中的 Mmi1 基因都是 readers 类蛋白。 这些酶能 够识别发生m6A 甲基化的碱基，参与下游翻译、 mRNA 降解、加快 mRNA 出核速度等作用 。如图4C 中所示， YTHDF2 参与 mRNA 降解过程
10、。 图 4 m6A 分子途径和细胞功能（ Mihye Lee et al (2014) Cell, 158: 980） 好了，让我们再来系统地回顾一下，参加 m6A 甲基化的酶到底有哪几类。从图 4B 中，我们可以看到 RNA 的 m6A 甲基化一共有大三类酶参与： Writers、 Erasers 和 Readers，具体信息如下表所示。 参考文献 1. Fu, Y., Dan, D., Rechavi, G., & He, C*. “Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation.“ Na
11、ture Reviews Genetics 15.5 (2014):293-306. 2. Roundtree, I. A., Evans, M. E., Pan, T., & He, C*. “Dynamic RNA Modifications in Gene Expression Regulation.“ Cell 169.7 (2017):1187. 3. Cantara, William A., et al. “The RNA modification database, RNAMDB: 2011 update.“ Nucleic Acids Research 39.Database
12、issue(2011):D195. 4. Lee, M., B. Kim, & A. V. N. Kim*. “Review: Emerging Roles of RNA Modification: m6A and U-Tail.“ Cell 158.5 (2014):980. 5. Cohn, W. E*. “Pseudouridine, a carbon-carbon linked ribonucleoside in ribonucleic acids: isolation, structure, and chemical characteristics.“ Journal of Biol
13、ogical Chemistry 235.235 (1960):1488. 6. Holley, R. W., Everett, G. A., Madison, J. T., & Zamir, A*. “NUCLEOTIDE SEQUENCES IN THE YEAST ALANINE TRANSFER RIBONUCLEIC ACID.“ Journal of Biological Chemistry 240 (1965):2122. 7. Alarcn, C. R., et al. “HNRNPA2B1 Is a Mediator of m(6)A-Dependent Nuclear RNA Processing Events. “ Cell 162.6 (2015):1299-1308. (客户文章 ) 8. Alarcn, C. R., et al. “N6-methyladenosine marks primary microRNAs for processing.“ Nature 519.7544(2015):482. (客户文章 )
