1、16S 全长通用引物：8F AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG1492R GGT TAC CTT GTT ACG ACT T或sgF AGA GTT TGA TCA TGG CTC AGsgR TAG GGT TAC CTT GTT ACG ACT T8F/1492R 使用最普遍，效果的确不错；但我们的经验是 sgF/sgR（上海生工公司扩 16S 推荐的引物）效果更好。这 2 对引物对应的 PCR 产物都在 1.5kb 左右。16S V6 区通用引物：V6-967F CAACGCGAAGAACCTTACCV6-1046R CGACAGCCATGCANCACCT这对引物也是我
2、们用过的，效果很好。对应的 PCR 产物约 90bp（V6 区平均长度 80-100bp，一说 79bp） 。引物到后，先在迷你离心机上短暂离心，将黏附在管口、管壁、管盖的核苷酸粉末甩到管底，然后在超净台操作（因为 16S 序列所有细菌里都有，扩增时很容易混入杂菌，因此本实验涉及的每一种试剂、耗材都要非常小心，保证无污染）：按照引物合成单的说明，加入灭菌的 TE 缓冲液，如果没有，灭菌的双蒸水也行（注意每 OD 加入量不等于最终加入量，一般引物合成是 2OD） 。溶解核苷酸粉末后，用枪头吹吸混匀。取 5L 溶液转移到另一个灭菌的 EP 管，加入 45 L 灭菌的双蒸水，即稀释 10 倍，此时引
3、物浓度为 10M，也就是工作浓度。最好分装保存，避免多次使用导致反复冻融，造成引物不稳定。以 genomic DNA 为模板，最适模板量为 0.1-10 ng，多了可能引发非特异性扩增，少了可能扩不出来，所以要先稀释。PCR 体系建议 25L，效果远好于 50L。推荐用 TAKARA的 LA Taq（保真度是普通 Taq 的 6.5 倍，扩增效率也较高）或 FINNZYMES 的Phusion（保真度是普通 Taq 的 50 倍，pfu 的 6 倍） ，以保证 16S 测序结果可信。PCR 体系：模板 1L引物 F 0.5L引物 R 0.5LdNTP（10 mM） 0.5LLA Taq（5U/
4、L） 0.5L10PCR buffer 2.5L灭菌水 19.5L总体积 25L模板 1L引物 F 0.5L引物 R 0.5LPhusion 12.5L灭菌水 10.5L总体积 25L注意：1、PCR 加样过程要在超净台进行。操作前先开紫外灯 30 min，关闭后再开风机 10 min，再用酒精棉球清洁台面和双手，方可开始操作。2、一定要做阴性对照（不加模板，其余成分都加）！3、所用 PCR 管、枪头、水均须严格灭菌。4、加样过程中，每一管管盖开的时间不要太久，加完立刻扣上盖子，再加下一管，避免交叉污染（genomic DNA 浓度通常很高，在空气中容易逸散） 。5、加样在冰盒上操作，加完轻轻
5、吹吸，短暂离心，保证各组分均匀混合。PCR 程序：针对全长：94 4 min94 30 s65 40 s72 90 s72 10 min4 针对 V6 区：94 4 min94 30 s55 30 s72 10 s72 5 min4 注意：Phusion 的扩增效率较 LA Taq 低，所以如果 Phusion 扩不出，可适当增加 3-5 个循环数。电泳检测：配制 1%（16S 全长）或 3%（V6 区）琼脂糖凝胶样品 PCR 产物和阴性对照 PCR 产物各取 4L，混合 0.5L 6loading buffer 点样，并点 DL2000 Marker（16S 全长）或 50 bp ladder Marker（V6 区）1 TAE，115V ，电泳 45-60minEB 染色 15 min紫外凝胶成像仪拍摄电泳照片正确的结果应该是：1.5kb 单一亮带（16S 全长）或稍小于 100bp（V6 区）单一亮带，阴性对照无条带。30 cycles30 cycles
