1、1AmpC 酶AmpC 酶是 AmpC 内酰胺酶的简称。 是由肠杆菌科细菌或和绿脓假单胞菌的染色体或质粒介导产生的一类 内酰胺酶,属 内酰胺酶 Ambler 分子结构分类法中的 C 类和 Bush Jacoby Medeiros 功能分类法中第一群,即作用于头孢菌素、且不被克拉维酸所抑制的 内酰胺酶。故 AmpC 酶又称作为头孢菌素酶。AmpC 酶按其产生的方式分为 3 类:诱导高产酶、持续高产酶和持续低产酶。(1) 诱导高产酶:AmpC 酶的合成往往与 2 内酰胺类抗生素的存在有关。绝大部分肠杆菌科细菌和绿脓假单胞菌在正常条件下(即无 内酰胺类抗生素存在的条件下) 只产生少量的 AmpC 酶
2、。而当有诱导作用的 内酰胺类抗生素存在的条件下,AmpC 酶的产量明显增加,增加的范围在 1001 000 倍之间。(2) 持续高产酶:另有一部分产 AmpC 酶的菌株不论在有无 内酰胺类抗生素存在的条件下均可持续高水平产生 AmpC 酶,其原因为去阻遏突变,即调控基因之一的 ampD 基因发生突变,产生的有缺陷的 AmpD 蛋白,不能与另一种调控蛋白AmpR 蛋白结合形成复合物,AmpR 蛋白即以激活子状态发挥激活作用,引起 AmpC 酶的大量表达。质粒介导的 AmpC 酶往往都属于此类 AmpC 酶。产生这种 AmpC 酶的细菌对临床的危害最大,是临床微生物实验室检测的重点。(3) 持续低
3、产酶:还有极少部分产 AmpC 酶的菌株,不论在有无 内酰胺类抗生素的存在的条件下均持续低水平的产生AmpC 酶,其原因可能是另一种调节基因ampR 基因发生突变, 产生有缺陷的 AmpR 蛋白,不能在无 内酰胺类抗生素存在的条件下起到抑制子的作用,也不能在有 内酰胺类抗生素存在的条件下起到激活子的作用,故 AmpC 酶得以持续低水平地表达。检测不同类型的 AmpC 酶或检测产不同类型 AmpC 酶的菌株,其方法也有所不同。近年来,随着 内酰胺类抗生素、尤其是头孢菌素的广泛应用,产 AmpC 酶的革兰阴性杆菌越来越多见,尤其是出现了(去阻遏) 持续高产 AmpC 酶和质粒介导的 AmpC 酶,
4、导致耐药菌株广泛传播和临床对该类细菌感染的治疗困难,已引起临床的高度重视,故检测 AmpC 酶具有非常重要的临床意义。产 AmpC 菌株的检测1)头孢西丁敏感试验：AmpC 酶可以水解头孢西丁（FOX），即产 AmpC 酶的菌株对头孢西丁耐药。而超广谱 内酰胺酶（ESBLs）等其他 内酰胺酶一般不能分解头孢西丁，即产 ESBLs 的菌株对头孢西丁敏感。利用 AmpC 酶的这一特性，可以对产 AmpC 酶的菌株进行初步筛选。2)三维试验：三维试验也是利用 AmpC 酶可以水解头孢西丁的原理，先用冻融法或超声粉碎法将待检菌株中的 内酰胺酶提取出来（粗提），观察这种酶的粗提物对头孢西丁的抑制情况。如
5、果粗提物中有 AmpC 酶存在，即可抑制头孢西丁的活性，使其周围对头孢西丁敏感的大肠埃希菌得以生长;反之，大肠埃希菌受头孢西丁的抑制则不能生长。检测不同类型的 AmpC 酶或检测产不同类型 AmpC 酶的菌株，其方法也有所不同。已陆续报道了多种检测 AmpC 酶的方法，除改良的三维试验较为经典外，其他的检测方法还不成熟，尚在摸索，试验阶段，检测的结果也各不相同。现讲述如下。2.1 头孢西丁敏感试验 AmpC 酶可以水解头孢西丁（FOX） ，即产 AmpC 酶的菌株对头孢西丁耐药。而超广谱 内酰胺酶（ESBLs）等其他 内酰胺酶一般不能分解头孢西丁，即产 ESBLs 的菌株对头孢西丁敏感。利用
6、AmpC 酶的这一特性，可以对产 AmpC 酶的菌株进行初步筛选。具体操作方法:（1）纸片扩散法:按美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）的纸片扩散（K-B）法进行。FOX 纸片的含量为 30g。判断标准为抑菌环16g/ml 表示待检菌株对 FOX 耐药。对 FOX 耐药的菌株，应怀疑产 AmpC 酶可能。但是 Coudron 等利用该标准检测肺炎克雷伯菌，大肠埃希菌和奇异变形杆菌 AmpC 酶时发现 28 株头孢西丁抑菌环18mm 的肺炎克雷伯菌中，只有 4 株产 AmpC 酶，有 2 株产 AmpC 酶的大肠埃希菌的抑菌环分别为 17mm 和 18mm。故此方法仅仅作为初步筛选。需做三维
7、试验或纸片协同试验等试验，进行进一步的确定。2.2 三维试验 三维试验也是利用 AmpC 酶可以水解头孢西丁的原理，先用冻融法或超声粉碎法将待检菌株中的 内酰胺酶提取出来（粗提） ，观察这种酶的粗提物对头孢西丁的抑制情况。如果粗提物中有 AmpC 酶存在，即可抑制头孢西丁的活性，使其周围对头孢西丁敏感的大肠埃希菌得以生长;反之，大肠埃希菌受头孢西丁的抑制则不能生长。具体操作方法:（1）制备 内酰胺酶的粗提物:将待检菌株接种在 M-H 肉汤或胰蛋白大豆胨水中增菌，离心收集细菌，用 0.01mmol/L 的磷酸盐缓冲液或 PBS（pH7.0）冲洗后制成一定浓度的细菌液，再用冻融法（-70快速冷冻、
8、室温或 37水浴快速解决，反复 5 次）或超声粉碎法（4，超声粉碎）破碎菌细胞，使其菌体内的酶释放出来，再离心（12，000r/min，1h）去除细菌碎片，收集上清液即为 内酰胺酶的粗提物。取部分上清液接种 M-H 平板常规培养，证实无活菌存在。再用头孢硝噻吩纸片确定有 内酰胺酶的存在。 （2）三维试验:将大肠埃希菌标准菌株 ATCC25922 按 NCCLS2的 K-B 法涂布在 M-H 平板上，在平板的中央贴一张 FOX 纸片，从距离纸片 5mm 处用无菌刀片在平板的琼脂上向外缘方向（离心方向）切一裂隙（一块平板可切 45 条裂隙） ，每一裂隙中加入 2530l 的一种待检菌株的 内酰胺粗
9、提物（注意 内酰胺酶粗提物不可溢出裂隙） ，35培养 1824h，观察裂隙的内侧端（头孢西丁纸片的抑菌环内）周围有无细菌生长。判断标准:裂隙的内侧端周围有细菌生长、导致头孢西丁纸片的抑菌环有缺失者为阳性，表明该裂隙内的 内酰胺酶为 AmpC 酶，也就是说这种待检细菌产 AmpC 酶。缺点是需增菌、破碎菌细胞并提取酶的粗提物，操作繁琐、费时，难以在临床微生物实验室常规应用。2.3 AmpC 酶表型筛选试验 根据 AmpC 酶对大部分头孢菌素、尤其是三代头孢菌素耐药的特性，选用多种头孢菌素纸片对产 AmpC 酶的菌株进行表型筛选。可选用亚胺培南（IP） 、头孢吡肟（FEP） 、头孢他啶/克拉维酸（
10、CTD/Cla） 、头孢噻肟（CTX）和头孢噻肟/克拉维酸（CTX/Cla）5 种抗生素纸片进行筛选试验。具体操作方法按 NCCDS 的 K-B 法进行。判断标准:（1）IP、FEP 敏感，而 CTX、CTD/Cla 和 CTX/Cla 耐药;（2）IP、FEP 敏感，在 CTX、CTD/Cla 和 CTX/CIa 的抑菌环内存在散在的菌落;（3）IP 敏感，而 FEP、CTD/Cla 和 CTX/Cla 耐药。以上 3 种结果提示，待检菌株产 AmpC 酶。最后一种表型提示，待检菌株产 AmpC 酶的同时，产生其他 内酰胺酶，如产 ESBLs。此方法操作简便、快速省时，较三维试验简单得多，结
11、果基本可靠，与三维试验的符合率达 89.58%。可以在各临床微生物实验室推广应用。2.4 氟氯西林（FCC）双抑制剂扩散协同试验 氟氯西林（FCC）可抑制 AmpC 酶的活性，使产 AmpC 酶的菌株不能及时水解和破坏头孢菌素，保留了这些抗生素的抗菌活性。利用这一特性，可选用 FCC 与其他超广谱头孢菌素（ESC）进行双抑制剂扩散协同试验（double inhibitors diffuse synergy test，DIDST） ，观察其有无协同作用。因 PCC 在琼脂中扩散能力较差，故试验过程中不直接选用 FCC 纸片，而是将 FCC 药液直接加在空白纸片上进行扩散，这样才能观察到协同试验的
12、效果。具体操作方法:在 M-H 平板上均匀涂布待检菌株，中央贴一空白纸片，并在其周围 2025mm 处贴上 CTD、头孢曲松（CRO） 、头孢哌酮（CFP） 、氨曲南（ATN） 、CTX 和 CPI 纸片，再在空白纸片上滴加 10mg/ml FCC20l，35孵育1824h，观察纸片之间的抑菌环情况。FCC 与任何一种头孢菌素协同为阳性，提示产 AmpC 酶。此方法与 AmpC 酶表型筛选试验相仿，即采用纸片扩散方法即可快速检测 AmpC 酶，操作简便、快速省时。结果基础可靠，可以在各临床微生物实验室推广应用。2.5 等电聚焦及氟氯西林抑制试验 6，8，10 AmpC 酶的等电点相对集中，为
13、6.010.0，且9.0，故可用物理方法先将其从待检菌细胞中释放出来，制成酶的粗提物，再用等电聚集的方法在琼脂糖凝胶板上将其与其他 内酰胺酶或其他蛋白成分分开。头孢硝噻吩（nitrocephin）是一种标记有硝基环的头孢菌素，溶于水后呈黄色，被 内酰胺酶（包括AmpC 酶）水解后呈红色。氟氯西林可以抑制 AmpC 酶的活性，而对其他 内酰胺酶的活性则无明显的抑制作用。若先用氟氯西林对凝胶板上的酶进行抑制，再用头孢硝噻吩进行显色反应，被抑制掉的条件即可能为 AmpC 酶条带。具体操作方法:用超声粉碎法制备待检细菌中的 内酰胺酶粗提物，再用 Phastsystem 电泳法进行等电聚焦（用两份同种
14、内酰胺酶粗提物跑出两块凝胶板，电泳的条件完全相同） 。将一用氟氯西林（1mmol/L）浸润的滤纸条覆盖在第一块凝胶板（A 板）上，而第二块凝胶板（B 板）上仅覆盖用无菌蒸馏水浸润的滤纸条。30 秒后去除两块凝胶板上的滤纸，再分别覆盖上浸润头孢硝噻吩（500g/ml）的滤纸条。1min 后揭去滤纸条，观察凝胶板上各条带的显色情况。结果判断:如果 A、B 两块凝胶板上的条带颜色不同，即在 B 板上变色（由黄变红者） 、而在 A 板上不变色（仍为黄色）的条带，即为 AmpC 酶，表明待检菌株产 AmpC 酶。与三维试验相同，该方法也是利用酶的粗提物而不是 活菌作检测，不受抗生素的诱导影响，也是用来检
15、测（却阻遏）持续高产 AmpC 酶的方法，也可检测质粒 AmpC 酶。但缺点是较三维试验繁琐、费时，不宜在临床微生物实验室推广应用。以上综述了目前检测 AmpC 酶的各种方法。头孢西丁敏感试验（包括纸片扩散法和肉汤稀释法）因操作简便，可作为临床微生物实验室检测 AmpC 酶的日常筛选方法。AmpC 酶表型筛选试验和氟氯西林双纸片扩散协同实验均利用纸片扩散法对产 AmpC 酶的菌株进行检测，操作简便，快速省时，结果基本可靠，可以在各临床微生物实验室推广应用。三维试验和等电聚焦及氟氯西林抑制试验均是检测细菌胞体内 AmpC 酶的活性，不存在抗生素的诱导作用，故检测的是（去阻遏）持续高产AmpC 酶
16、，AmpC 酶也可检测质粒 AmpC 酶。尤其是三维实验是目前公认的质粒 AmpC 酶或（却阻遏）持续高产的经典方法。但两种方法缺点是需增菌、破碎菌细胞并提取酶的粗提物，操作繁琐、费时，难以在临床微生物实验室常规应用。3近年来，随着 内酰胺类抗生素、尤其是头孢菌素的广泛应用，产 AmpC 酶的革兰阴性杆菌越来越多见，尤其是出现了（去阻遏）持续高产 AmpC 酶和质粒介导的 AmpC 酶，导致耐药菌株广泛传播和临床对该类细菌感染的治疗困难，已引起临床的高度重视，故检测 AmpC 酶具有非常重要的临床意义。-内酰胺酶（-lactamase）（ 酶）的产生是细菌对( 内酰胺类)抗菌药物耐药最常见的机
17、制,广泛地涉及到许多社区获得性感染和医院内感染的重要病原菌。-内酰胺酶的产生是抗生素耐药的最常见的机制，在各种耐药机制中占80%。-内酰胺酶是由多种酶组成的酶家族，能水解 内酰胺抗生素。这些酶的基因存在于细菌的染色体或质粒中。分类比较多而复杂，这里总结了最常用的两种，以便大家在阅读文献和应用中理清思路。Bush 酶分类：根据生化特征或氨基酸序列的同源性，-内酰胺酶可分为下列四类。1 第一类为头孢菌素水解酶（Amp-C 酶），产生菌主要系革兰阴性菌，如假单胞菌、肠杆菌、不动杆菌和克雷伯杆菌等，由染色体介导。2 第二类为青霉素酶和超广谱酶，包括革兰阳性菌的青霉素酶，质粒介导的 TEM 和 SHV
18、酶及其衍生物组成的超广谱 -内酰胺酶（ESBLs）、羧苄青霉素酶、邻氯青霉素酶（OXA 酶）和由沙雷菌属与肠杆菌属产生的非金属碳青霉烯酶。3 第三类为金属酶，由假单胞菌属、脆弱拟杆菌属、产黄菌属、沙雷菌属及嗜麦芽黄单胞杆菌属产生的可水解碳青霉烯抗生素的金属酶。4 第四类为其他不能被克拉维酸完全抑制的青霉素酶。Frere 酶分类（Ambler 分类）：于 酶的特殊性、动力学参数及其基因的核苷酸序列，将 酶分为 A、B、C、D 四类A 活性部位为丝氨酸残基，包括多种质粒编码的青霉素酶，如 TEM1、SHV1、ROB1 或 PC1 酶，相对分子质量 29 000。B 为金属酶(metalloenzy
19、mes)，活性部位为半胱氨酸残基，产金属酶的细菌有嗜麦芽黄杆菌(stenotrophomonas maltophila)，气单胞菌和脆性拟杆菌 7 。该类为碳青霉烯酶，耐药的抗生素包括碳青霉烯、青霉素、第一、二、三代头孢菌素、氨曲南.C 活性部位为丝氨酸残基，相对分子质量为 39 000，它的产生与 -酶诱导剂有关，归因于调控基因突变，主要是染色体编码的头孢菌素酶(AmpC 酶)是由染色体上一组 Amp 基因介导的。D 为青霉素酶，包括 OXA肠杆菌科肠杆菌科细菌分布广，寄主范围大，人、动物、植物都有寄生或共生、附生、腐生，也可在土壤或水中生存，与人类关系密切。肠杆菌科细菌易于培养，繁殖快（在
20、适宜条件下每 2030 分钟可增殖 1 代）。有些种如大肠杆菌是研究遗传学和分子生物学的重要材料。中文名称： 肠杆菌科外文名称： Enterobacteriaceae界： 细菌界门： 变形菌门(Proteobacteria)纲： -变形菌纲(-proteobacteria)目： 肠杆菌目(Enterobacteriales)自 1937 年拉恩提出建立肠杆菌科以来，所含属的范围几经变动。一般该科下分 5 族、12 属，各族、属的主要鉴别特征见下表。4主要鉴别特征族和属 GC克分子%最适生长温度发酵产物 动力对乳糖发酵 从糖产气备注1、埃希氏菌族埃希氏菌属 50-53 37 混合酸 肠道病菌爱德
21、华氏菌属 50-53 37 混合酸 肠道病菌柠檬酸杆菌属 50-53 37 混合酸 肠道病菌沙门氏菌属 50-53 37 混合酸 肠道病菌志贺氏菌属 50-53 37 混合酸 多数阴性 肠道病菌2、克雷伯氏菌族克雷伯氏菌属 52-59 37 中性溶剂 呼吸道病菌，产红色素肠杆菌属 52-59 37 中性溶剂 呼吸道病菌，产红色素哈夫尼菌属 52-59 37 中性溶剂 （迟） 呼吸道病菌，产红色素沙雷氏菌属 52-59 37 中性溶剂 （迟） 呼吸道病菌，产红色素3、变形杆菌族变形杆菌属 39-42 37 混合酸和中性溶剂 4、耶尔森氏菌族耶尔森氏菌属 45-47 30-37 混合酸 多数阴性（
22、迟） 啮齿类和人类致病菌5、欧文氏菌族欧文氏菌属 50-58 27-30 混合酸和中性 植物致病菌5溶剂：阳性；：多数阳性；：阴性 1常见种属大肠杆菌埃希氏菌属：该属只有大肠杆菌 1 种。沙门氏菌属：菌体大小（0.60.9）微米（13 ）微米，无芽孢，一般无荚膜，除鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌外，大多周身有鞭毛。沙门氏菌通过动物的消化道传染致病，统称为沙门氏菌病。病型有伤寒与副伤寒（统称肠热症） 、食物中毒、败血症，还可引起慢性肠炎。志贺氏菌属：该属是人类细菌性痢疾的病原菌，通称痢疾杆菌。菌体大小（0.50.7 ）微米（2 3）微米，无芽孢，无鞭毛，无荚膜，有的菌株有菌毛，需氧或兼性厌氧，能
23、在普通培养基上生长。克雷伯氏菌属：短粗，无鞭毛，有荚膜，菌体大小（0.31.5）微米（0.66.0)微米，单个、成双或短链状排列，兼性厌氧，营养要求不高，在固体培养基上形成特征性的粘液状菌落。存在于土壤、水、谷物等自然界以及人或动物的呼吸道。当肌体免疫力降低时，能引起多种感染。有肺炎克雷伯氏杆菌、臭鼻克雷伯氏杆菌和鼻硬结克雷伯氏杆菌 3 种。沙雷氏菌属：能产生非水溶性的黄、紫和红色色素。一般存在于土壤、水、植物、动物以及人类的肠道和呼吸道中。有粘质沙雷氏菌、液化沙雷氏菌、深红沙雷氏菌等。粘质沙雷氏菌，又称灵杆菌，为细菌中最小者，周身鞭毛，能运动，无荚膜，无芽孢，约半数菌株能产生红色的灵菌素。因该菌小且有色素，常用于检定滤菌器的质量。变形杆菌属：是一类无芽孢、无荚膜、周身鞭毛、运动活泼、两端钝圆的小杆菌。菌体大小（0.40.6 ）微米（ 1.03.0) 微米，兼性厌氧，水、泥土、阴沟及各种腐败的动、植物中最多，它们是条件致病菌，在特殊情况下能使人致病。耶尔森氏菌属：为卵圆形、短小的杆菌。菌体大小（0.51.0）微米（1.02.0）微米。无芽孢，无荚膜，兼性厌氧。该属有鼠疫杆菌、假结核杆菌和肠结肠炎杆菌 3 种。鼠疫杆菌是鼠疫的病原菌。鼠疫在人群流行之前，常在鼠类中先流行。人患鼠疫后，可通过人蚤或呼吸道（肺型）在人间传播。 2
