1、第二章 酶(enzyme),第一节酶是生物催化剂,生物体的新陈代谢过程包含许多复杂而有规律的物质变化和能量变化。绿色植物利用光能将水和CO2、无机盐等简单物质，经过一系列化学变化，合成复杂的糖类、蛋白质、核酸和脂类等。动物能将各种食物经过复杂的分解和合成反应转化为自身的组成成分和所需的能量，得以生长、发育、运动和繁殖等。新陈代谢是生物其它仪器生命现象的基础。其中许多反应都是在酶的催化下进行的。,酶是细胞所产生的、具有催化能力的生物催化剂。它和一般催化剂比较，具有以下特点。,一、酶的催化特点,(1)催化效率高。比非催化高108-1020倍，比其它催化剂高107-1013倍。,(2)酶的作用具有高
2、度的专一性。一种酶只能催化一个或一类十分相似的反应。通常把酶作用的物质叫做底物。,相对专一性,绝对专一性: 酶对底物要求绝对严格,-葡萄糖苷酶,+H2O,CH 3CH2-O-CO(CH2)14-CH3,若酶只对顺反异构体中的一种起催化作用的现象称为几何 异构专一性。,酶对底物的专一性如何解释？,Emil Fisher(德，1984)提出锁钥学说：酶象一把锁， 酶的底物或底物的一部分犹如钥匙一样，能专一性地插 入到酶的活性中心部位而发生反应。,(3)酶容易失活。一般催化剂在一定条件下会因中毒而失去催化能力。而酶较其他催化剂更加脆弱，更容易失去活性。强酸强碱，高温等条件都能使酶破坏而完全失去活性。
3、只有在比较温和的条件下，如常温、常压、接近中性的pH条件等起催化作用。,(4)酶活性能受到调节控制。调节方式多种多样：共价修饰、抑制调节、反馈调节、酶原激活及激素调节等。,(5)酶催化活力与辅酶、辅基、金属离子有关。若将他们除去，酶就失去活性。,酶催化作用的高效性、专一性以及条件的温和性使酶在生物体 内新陈代谢中发挥强有力作用，酶活性的可控性是生命活动中 各个反应得以有条不紊地进行。,二、酶的化学本质,根据酶蛋白的分子特点将酶可分成三类：,1.单体酶：由一条肽链组成的酶。,一般都是催化水解的酶，如溶菌酶、胰蛋白酶、核糖核酸酶等。,2.寡聚酶：由两个及两个以上亚基组成的酶。亚基可以相同，也可以不
4、同。亚基之间是非共价结合的、彼此可以分开。例如磷酸化酶a和3-磷酸甘油醛脱氢酶等。,3.多酶复合体：有几种酶彼此嵌合形成的体系。这类酶催化效率高，容易调节，有利于一系列反应连续进行。例如丙酮酸脱氢酶复合体、脂肪酸合成酶复合体等。,表:含相同亚基的寡聚酶,表:含不同亚基的寡聚酶(P326),三、酶的化学组成分类,1.单成分酶(单纯酶)。仅有氨基酸组成的酶类。,2.结合酶类(双成分酶)：由酶蛋白部分和非蛋白两部分组成。,结合酶类,决定酶的专一性，即酶催化作用的底物,决定酶催化作用的性质，如氧化还原反应、基团转移、水解、裂解、合成等。,辅助因子,辅基-与酶蛋白结合较紧密，不易于脱离的辅助因子,辅酶-
5、与酶蛋白结合松弛，易于脱离的辅助因子,例如NAD+，NADP+，CoASH等。,例如FMN，FAD，血红素-Fe()等。,结合酶最大特点是，只有当辅助因子与酶蛋白结合成全酶才具有催化活性。相反，当酶蛋白或辅助因子单独存在时不具备催化作用。,总之，辅助因子在酶促反应过程中起质子、电子、基团传递者。,四、酶的活性中心概念与特点,酶在催化作用过程中，结合并催化底物发生变化的局部结构称为酶的活性中心。,简单酶的活性中心的化学本质是酶分子中少数在空间上靠近的、具有特定空间结构的、氨基酸残基侧链构成的局部结构。对于结合酶(双成分酶)的活性中心则是由酶蛋白中具有特定空间结构、少数侧链基团及辅助因子构成的局部
6、结构。,1.酶分子中活性中心必需基团：,酶分子中存在的与酶催化活性密切相关的基团称为酶的必需基团。,H+,质子与酯分子结合形成烊盐，通过增加羰基碳的正电性，削弱了酯键，使水分子的氧原子更容易进攻而加入。,酶是如何加速化学反应的？,一些酶活性中心中的残基或基团,活性中心必需基团常见的有His侧链的咪唑基、Ser-CH2-OH、Cys-SH，Glu-COO-，Asp-COO-等。,弹性蛋白酶 His42,Asp87,Ser180. 羧肽酶A Arg145,Tyr248,Glu270,Zn2+ 核糖核酸酶 His12,Lys41,His119 溶菌酶 Glu35,Asp52,酶名称 参与活性中心的残
7、基或基团,胰蛋白酶 His42,Asp87,Ser180,-胰凝乳蛋白酶 His57,Asp102,Ser195,Ile16,酶活性中心必需基团按照功能分为3类,与底物结合的基团,影响底物某些化学键稳定性，并催化 底物发生反应的基团称为催化基团。,虽不参加酶的催化过程，但确是维持酶活性中心的空间结构所必需的基团。,2.酶活性中心的一般特点,(1)酶的活性基团一般处于酶分子的一个洞穴或裂缝中，而且是一个相对的疏水环境，其中介电常数较低，异性电荷之间的作用较强，但仍属于弱作用力，这有利于酶的催化基团对底物发挥催化作用。,在生理条件下，它有一半以广义酸的形式存，另一半以广义碱的形式存在，即既能提供质
8、子，也能接受质子。适合酸碱催化的要求。其中的共轭碱形式中1个N:具有亲核催化能力。,a.咪唑基的pK值为6.77.1。,咪唑基是广义的、十分有效的酸、碱催化基团，又是亲核催化基团(剂)，其原因有两点：,(3).咪唑基作为催化基团常出现在活性中心。,(2)酶的活性中心是一个具有三维结构的实体，底物结构与其诱导匹配性决定酶的专一性。,b.半衰期小于0.1ns(毫微秒),即供出质子和接受质子的速度几乎相等，而且十分迅速。,三点附着学说:A.Ogster在研究甘油激酶催化甘油转变为磷酸甘油时提出的。酶具有立体异构专一性，是因为所作用的对映异构体中的底物分子上基团空间排布与酶活性中心基团相匹配时，酶才能
9、作用于这个底物分子。,活性中心必须基团在空间排布具有一定的方位，而底物 分子具有构型，其中的基团在空间的方位只有与活性中心 必须基团在空间方位匹配时，才能结合。,不匹配,底物与活性部位匹配,诱导契合学说：Koshland(1958)认为，酶分子构象是可变的，活性中心结构具有柔性。酶与底物结合时，酶分子受底物诱导，其构象发生变化，以利于催化基团和底物敏感键锲合，形成E-S复合物。,第二节酶的命名和分类,1. 氧化还原酶类(oxido-reductases)2转移酶类(transferases)3水解酶类(hydr0lases),4裂合酶类(裂解酶类，1yases)5异构酶类(isomerases
10、)6. 合成酶类，也称为连接酶(ligases),酶的系统名称原则(国际命名方法1961提出)：,“酶作用底物名”:“底物”(或辅助因子)+酶催化性质+ “酶”字,乳酸 +NAD+ = 丙酮酸 + NADH + H+,举例：,丙氨酸:酮戊二酸氨基转移酶(EC2.6.1.2),丙氨酸+-酮戊二酸=丙酮酸+谷氨酸,谷丙转氨酶,注意水解酶命名方法：“来源”+“底物”+ “酶”字,例如：牛胰RNase(RNAase)，胰蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，唾液淀粉酶等。,乙酰辅酶A:水解酶和乙酰辅酶A:水水解酶说法那个错？,酶系统命名：,1 氧化还原酶类及系统名 习惯命名 催化的反应 1.1 作用于供体CHOH 基
11、 1.1.1 以NAD+或NADP+为受体 1.1.1.1 醇:NAD+氧化还原酶 醇脱氢酶 醇+NAD+ 醛或酮+NADH 1.1.3 以O2为受体 1.1.3.4-D葡萄糖:氧氧化还原酶 葡萄糖氧 -D-葡萄糖+O2 酸-内 化酶 酯 +H2O2 1.2 作用于醛基或酮基 1.2.1 以NAD+或NADP+为受体 1.2.3 以O2为受体 1.2.3.2 黄嘌呤:氧氧化还原酶 黄嘌呤氧 黄嘌呤+O2 尿酸+H2O2化酶,“底物1:底物2”+催化反应性质+”酶”字,1、氧化还原酶类:顾名思义是催化氧化还原反应的酶。反应通式：AH2 + B = A + BH2如乙醇脱氢酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶
12、等。,二、六大类酶的特征,脱氢酶类的辅酶是NAD+或NADP+，FAD或FMN。有些酶可用NAD+也可用NADP+，如L-谷氨酸脱氢酶，苹果酸脱氢酶催化苹果酸脱氢的反应。,3、水解酶类催化底物的加水分解或其逆反应. 如胰蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、核酸酶等。该类酶包括9个 亚类，每一亚类表示被水解键的性质，如：,2、转移酶类:催化某一化合物上的某一基团转移到另一个化合物上。,如转甲基酶、转氨酶等。转移酶类包括8个亚类，每一亚类表示被转移基团的性质。如：,谷丙转 氨酶,3.1 水解酯键; 3.2 水解糖苷键; 3.3 水解肽键;,4、裂合酶类(裂解酶类)催化底物的裂解或其逆反应。 底物裂解时，一分为
13、二；产物中往往留下双键。在逆反应 中，催化某一基团加到这个双键上。,如醛缩酶催化l，6-二磷酸果糖分子断裂生成磷酸二羟丙酮和3-磷酸甘油醛的反应。,6、合成酶类,5、异构酶类催化同分异构体之间的相互转变。 如磷酸丙糖异构酶催化3-磷酸甘油醛和磷酸二经丙酮之间的相互转变。该类酶包括6个亚类，亚类表示异构作用的类型.,磷酸丙糖异构酶,A + B + ATP A-B + ADP + Pi,催化由两种或两种以上的物质合成一种物质的反应，且必须有 ATP参加。反应通式：,如丙酮酸羧化酶催化丙酮酸羧化为草酰乙酸的反应。,判断下列说法正确与否：,1.催化ATP+葡萄糖 6-磷酸葡萄糖+ADP的酶属于磷酸基团
14、转移酶。( ),2.蛋白质激酶属于合成酶。 ( ),3.醛缩酶属于裂合酶，所以系统名编号应该为EC4.X.X.X。 ( ),催化蛋白质磷酸化的酶。,第三节 酶的活力测定与计算,酶的活力就是酶加速其所催化的化学反应速度的能力。测定酶的活力就是测定酶促反应进行的速度。酶促反应速度越大酶的活力越强。酶的多少不能用重量单位或浓度单位来表示。因为酶不易制成纯品，特别是工业用的一些酶制剂常常含有很多杂质。所以，不能像化学纯品那样直接用重量或体积来表示它的多少。故酶的含量常常用酶的活力表示。,一、酶活力、活力单位和测定条件,酶的活力大小可以用在一定条件下它所催化的反应速度来表示。酶促反应速度则用单位时间内底
15、物的减少量或产物的增量表示。,国际单位：在最适条件下(25C)，每分钟内催化1mol底物转化为产物的酶量为1个酶活力单位(IU)。(1961年),实际应用IU常常很繁琐，人们往往采用习惯活力单位。,蛋白酶活力单位习惯定义：1个1min内将底物酪蛋白分解产生1g酪氨酸的酶量。,淀粉酶活力单位习惯定义：1小时内水解1g淀粉的酶量。有的部门则采取每小时分解1ml2%的淀粉溶液的酶量为1个活力单位。,1972年国际酶学委员会由推荐一种新的酶活力单位Katal(简写Kat)。1Kat为每秒钟内能使1mol底物转化为产物所需要的酶量。若每秒钟内使1mol底物转化的酶量则为1Kat。,1Kat=60106I
16、U,1IU = 1/60 Kat =16.67nKat,(nKat:纤Kat),酶活力测定条件：最适温度、最适pH、最适底物浓度和最适缓冲溶液的离子强度。,国际单位：在最适条件下(25C)，每分钟内催化1mol底物转化为产物的酶量为1个酶活力单位(IU)。(1961年),计算举例：现有1g淀粉酶制剂（干粉末），用蒸馏水溶解并定溶至1000ml，从中吸取0.5ml测定该酶活性，测定得知 5min分解0.25g淀粉。计算每g酶制剂（干粉末）所含的淀粉 酶活力单位数；经测定酶液蛋白氮为0.04mg/ml,计算淀粉酶 比活力为多少？（淀粉酶活力单位规定为：在最适条件下，每小时分解1g淀粉的酶量为1个活
17、力单位）。,酶活力/克酶制剂=,=6000(u),酶比活力=,=24,解题：,二、比活力,活力单位/毫克蛋白质(U/mg蛋白质)。,比活力用来表示每单位重量酶蛋白的催化能力。对于同一种酶来说，比活力越高，表明酶越纯。,表示方法：,三、酶的转换数(Kcat),酶的转换数为每秒钟每摩尔酶分子转换底物的摩尔数(mol)。,指每mg酶蛋白所具有的酶活力。,Kcat意义：Kcat相当于一旦底物-酶(ES)中间络合物形成后，酶将底物转换成产物的效率。,Kcat量值： Kcat=K3，K3表示米氏方程导出部分中的K3，是由ES形成产物的速度常数，而且是只有当所有的活性中心都被底物饱和时才有意义。,Kcat=
18、,=K3,酶比活力=,=560单位mg蛋白-1,酶的转换数是指每摩尔的酶(单体酶)或酶活性部位的摩尔数(含多个活性部位的酶)在单位时间内转化底物的摩尔数。,每个活性部位的转换数,=5600min-1,练习1(自完成):,碳酸酐酶催化H2O+CO2=H2CO3，碳酸酐酶的相对分子量为30000。如果10g纯的碳酸酐酶于37C及最适条件下，1min内催化0.30g的CO2水合，计算该酶的转换数。(2.010-7min-1),四、酶反应速度概念,酶的反应速度用单位时间内单位体积中底物的减少量来表示。酶速度单位：底物变化量/单位时间。,斜率=浓度/时间=v,图t1时间之内，酶促反应速度保持恒定。随时间
19、延长，酶促反应速度下降。,因此，测定酶促反应速度应该以初速度为准。,为了检验酶反应和测定反应系统是否正常，通常在测定时应该先制作两种曲线(直线)。(1)酶反应进程曲线，进而确定每反应初速度(如上图)。(2)根据酶反应初速度制作酶浓度曲线,其原因主要有：反应体系底物浓度下降，酶在一定pH及温度下部分失活，产物浓度增加对酶产生抑制及加速了逆反应速度等。,H+,第四节酶促反应动力学,主要研究酶反应速度规律以及各种因素对与酶反应速度的影响。,一、底物浓度对酶促反应速度的影响,反应体系E浓度保持恒定，增加S，测定底物变化量，得如下曲线。1902年 Brown首先提出中间复合物学说。,Vm,中间复合物学说
20、：,E + S E-S E + P,E表示游离酶,S表示游离底物,E-S表示酶-底物络合物,P酶作用的产物,产物P的生成速度代表整个酶催化的反应速度。而产物的生成速度取决于ES。因此整个酶反应的速度取决于ES大小。,曲线特征：,S很小(低)时，酶促反应速度与S成正比，表现为一级反应。,S再增大， V不再按正比升高。表现为混合级反应。,S增大到一定程度， V不会随S增大而增加，表现为零级反应。并接近最大反应。,E + S E-S E + P,当底物浓度比较高时，溶液中的酶全部与底物结合成中间络合物，没有游离的E。增加底物浓度也不会有更多的中间络合物形成，此时底物浓度与反应速度几乎没有关系。反应达
21、到最大反应速度。,二、米氏方程的导出,E + S E-S E + P,1913年Leonor Michaeli & Maud Menten建立了十分简单的动力学方程比较准确地反映了酶促动力学原理。1925年Briggs & Haldane对米氏方程作了修正。,酶促反应分步进行，第一步是E与S结合生成酶-底物络合物(ES)，经催化生成产物P并脱离酶。,产物P的生成速度代表整个酶催化的反应速度。而产物的生成速度取决于ES。因此整个酶反应的速度就取决于ES。,ES的形成量不仅与E+S有关，而且与P+E有关。当S很低酶反应处于初速度阶段，P的量更少，P+E生成ES的速度极小，可以忽略不计。,ES的形成
22、速度=K1ES,ES的分解速度=(K2+K3)ES,V=K3ES,当整个酶反应体系处于动态平衡，即ES的生成速度等于分解速度，此时有：,K1ES = (K2+K3)ES,(1),(2),令：,并代入上式，可得：,E代表的是未与底物结合的游离酶浓度，即：,E=EtES,(3),代入上式(3)，可得：,(4),整理(4)式，得：,ES=,因为： V=K3ES,所以：,V=K3ES,(引入米氏常数),V=K3ES,当底物浓度达到很高时，所有酶都被S结合成ES，即,Et=ES,此时，酶促反应达到了最大反应速度：,Vm= K3ES = K3Et,代入上式，可得：,V=,上式则为修正后的米氏方程。,(一)
23、米氏方程讨论：,=Vm=K3ES,零级反应,1.当S很低时，即 S Km, 但 S E ，这时V S，即为一级反应；,2.当S很高时，即 S Km， Km 可忽略不计：,一级反应,3.令V =1/2 Vm，并代入米氏方程,得：,即：2S=Km + S ,Km= S ,Km 含义： 就是当酶促反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度，单位：mol/L或mmol/L。,当某种酶能催化2种底物变化时，对于S1达到最大反应速度一半时需要的S1和催化S2达到最大反应速度一半需要S2谁大、谁小？,S1,S2,酶对作用底物的Km 越小，表明酶对该种底物的亲和力越大。相反，酶对所作用底物的Km越大，亲和力就越
24、小。因此，Km大小是酶对特定底物亲和力大小的度量的尺度。,(二)米氏常数的意义,1.Km值是酶的一个基本特征性常数,对于特定的反应来说Km是酶的特征性常数。它的大小与酶的性质有关，和酶的浓度无关。而与具体的底物有关，并且随温度pH和离子强度的改变而改变。不同酶对底物的Km值不同，通过 Km值，可以鉴别酶。,2.从Km值可以判断酶的专一性和天然底物,一些专一性差的酶往往可作用几种底物，并对应几个Km值。其中Km最小的，通常就是该酶的天然底物。,溶菌酶 N-乙酰氨基葡萄糖 610-6-半乳糖苷酶 乳糖 4 10-3碳酸酐酶 CO2 810-3苏氨酸脱氨酶 苏氨酸 510-3丙酮酸羧化酶 丙酮酸 4
25、 10-4HCO3- 1 10-3精氨酸-tRNA合成酶 精氨酸 3 10-6tRNA 4 10-7ATP 3 10-4,3.从Km的大小可以知道正确测定酶活性时所需底物浓度。,例题：计算当反应速度达到最大反应的99%时，底物浓度应改为多大？,解：,99%Vm=,S=99Km,4.Km值可以判断某一代谢物在体内可能的代谢途径。,当丙酮酸浓度比较低时，此时丙酮酸循那条代谢路经而变化？,答：循酶对底物亲和力最大的途径代谢。即Km最小的途径代谢。,Km、 Vm的确定，主要依据实验结果计算。,用v =1/2Vm, Km= S 的方法求KmVm值有几个问题需要注意：,双倒数作图法,（三）、米氏常数的求解
26、, Vm 测不准； 高底物浓度时所生成的大量产物是否对反应有抑制作用； 高底物浓度是否能溶解。,此方法简便，应用最多，但实验点过分集中在直线左端，作图不易准确。,第五节影响酶作用的因素,一、温度对酶反应速度的影响,1、酶促反应和一般反应一样，温度升高，反应物的能量增加，因而反应速度加快；,2、随温度继续升高，酶分子吸收了过多的能量使维持酶分子空间构象的次级键断裂，导致热变性，因而反应速度迅速下降。,大多数酶最适温度在3045C左右，在60C以上则趣于变性。少数酶能耐高温。如细菌淀粉酶在93C时活力最高，牛胰核糖核酸酶加热到100C仍不失活。,二、pH对酶反应速度的影响,大多数酶在某一pH时的反
27、应速度达到最高值，低于或高于此pH值时反应速度有所降低，这个pH叫作酶的最适pH值。pH和酶的反应速度关系曲线一般呈钟形。,酶 最适pH 胃蛋白酶 1.5 木瓜蛋白酶 4 10 胰蛋白酶 2.5(30C24小时) 胰蛋白酶 110(0C反应15分) 蔗糖转化酶 37.5活性几乎不变,最适pH值,1.pH对酶分子本身稳定性有 影 响；过酸或过碱，酶变性失活。 2.pH对酶分子活性中心外必需基团解离程度的影响； 3.pH对底物分子解离状况的影响；最适pH时酶活性中心必需基团解离状态和底物解离状态最有利于两者的作用，故酶的活性最高。,4.酶在体外反应的pH与它所在正常细胞的生理pH不一定完全相同。因
28、为细胞内可能会有几百种酶，可能一些酶的最适pH是细胞的生理pH，而另一些酶则不是。不同酶表现出不同活性。这种差异对于控制细胞内复杂的代谢途径可能具有很重要的意义。,三、激活剂对酶活性的影响,凡是能够提高酶活力的化合物称为酶的激活剂。,激活剂 按其分子量大小可分为以下三种:,无机离子激活机理,1.无机离子激活剂如Cl-、Br-、某些金属离子、Na+ 、K+ 、 Mg2+ 、Ca2+ 、Zn2+ ，Mn2+等。,活性中心必需成分；,-淀粉酶：Na+ ，K+，Ca2+(稳定酶的活性构象),稳定酶的活性构象；,在活性中心与底物之间起桥梁作。,例如：,合成酶：Mg2+，Ca2+(酶与底物之间的桥梁),羧
29、肽酶：Zn2+ (活性中心必要组分),唾液淀粉酶：Cl-(维持酶的活性构象),2.一些小分子的有机化合物,酶 激活剂 巯基酶 Cys、GSH 脂肪酶 牛黄胆酸钠 蛋白激酶 cAMP,Mg2+ 磷酸果糖激酶 ATP,3.生物大分子激活剂,一些蛋白激酶对某些酶共价磷酸化修饰而激活，在生物体代 谢活动中起重要的作用。,4.酶原与酶原激活系统,胰蛋白酶原激活,酶原与酶原激活的概念：,生物机体中的部分酶（如消化系统的酶类）在刚合成出来时不具有催化活性，即属于一种无活性的酶的前体，它的活性中心被掩埋在分子的内部或尚未形成，需要经过一定的剪切，使其肽链重新盘绕，活性中心方能暴露或形成。这类无活性酶的前体称为
30、酶原(zymogen或proenzyme)。,由酶原转变为有活性酶的过程称为酶原激活。,例如：,胰蛋白酶原,胰腺合成分泌,进入小肠消化蛋白,胰蛋白酶原（无活性）,胰蛋白酶（有活性）,肠激酶Ca2+,223肽,229肽,特点及意义：酶原激活是生物的一种调控机制。激活酶原的酶具有组织特异性，因此，酶原只有被运送到一定的组织后才能受相应的酶作用而被激活。这种方式有利于调节和对组织起保护作用。消化类、血液凝固系统等的酶多属此类酶。,又如：,1不可逆的抑制作用特点：EI共价结合，E失活，不可逆。,四、抑制剂(inhibitor I)的抑制作用,凡是能与酶分子上的某些基团，主要是活性中心的一些基团 结合，
31、使酶活性中心的结构和性质发生改变，从而引起酶活 力下降或丧失的物质，称为抑制剂。,(1)重金属离子、有机汞、有机砷化合物如Pb2+、Hg2+及 含有Hg2+ 、Ag+ 、As2+离于的化合物可与某些酶活性 中 心的必需基团如巯基结合而使酶失去活性。化学毒剂 “路易士气”就是一种含砷的化合物，它能抑制需巯 基 的酶的活性。,(2)有机磷化合物 如有机磷农药，敌敌畏，敌百虫等，能 与酶(如乙酰胆碱酯酶)活性中心上的丝氨酸以共价键结合而 使酶丧失活性。抑制剂对胆碱酯酶抑制作用。,+HOCH2CH2N+(CH3)3,乙酰胆碱不能及时地分解掉，造成突触间隙乙酰胆碱的积蓄， 进而使神经持续过度兴奋。此时引
32、起抽搐，最终导致死亡。 因此，有机磷类物质又称为神经毒剂。,(3)氰化物和一氧化碳 这些物质能与金属离子形成稳定的络合物，而使一些需要 金属离子的酶活性受到抑制。如含铁卟啉辅基的细胞色素 氧化酶。,2可逆的抑制作用,抑制剂与酶以非共价键方式结合而引起酶的活性降低或丧 失，用透析超滤等方法可除去抑制剂而使酶恢复活性，此 种抑制作用称为可逆的抑制作(reversible inhibition)。主要有 下列三种。,(1)竞争性抑制作用(competitive inhibition),特点：I与S结构相似，两者竞争E的活性中心。E-I不能再结合S，同样E-S不能再结合I。,I抑制程度与I/S有关；,
33、增加S可消除I的抑制用。,(2)非竞争性抑制作用(nocompetitive inhibition),E + S ES E + P,I,三元复合物中的底物不会变为产物。相当于该系统E有效浓 度减小，整个体系酶催化反应速度降低。,特点：I与S结构毫无相似之处，I结合部位与底物不同；,I抑制程度仅仅与I及I与酶的亲和力大小有关；,增加S不能消除I的抑制作用。,E + S ES E + P,(3)反竞争性抑制作用(uncompctitive inhibition),三元复合物中的酶 不能促使底物变化， 相当于酶的有效浓度 减小，体系酶催化反 应速度降低。,I ESI 无产物生成,竞争性抑制：当抑制剂
34、浓度增加时，Km减小，随底物浓度增加又会逐渐恢复；非竞争性抑制：抑制剂浓度增加，Km不变，随底物浓度增加，结合抑制剂的酶不会复原。,当体系存在反竟争性抑制剂时, Km减小,Vm 也减小，斜率不变。,Km,Vm,斜率,增大 不变 减小,不变 减小 减小,增大 增大 不变,*以双倒作图法的变化为基础进行的讨论。,第六节 酶催化作用机制,实质：酶能降低反应的活化能。,化学变化的实质就是旧键断裂，新键形成。催化剂的作用实 质是什么？,换言之：削弱底物反应部位的敏感键，使其更容易断裂，进而形成新的化学键。,酶与底物作用时通过那些方式削弱化学键的？,诱导契合学说 邻近与定向效应 酸碱催化 共价催化 微环境
35、的影响。,诱导契合学说,E-S,E活性中心与S结构不完全吻合,底物变产物E恢复原状,D.E.Koshland,1958提出，后通过羧肽酶等进行X光晶体衍射结果得以证实。,2.邻近与定向效应,底物分子与酶分子相比较要小的多，酶的活性中心是酶与底物的作用部位。酶的活性中心常常处于酶分子中的一个洞穴内。底物分子进入并能浓集于其中，这种现象称为“邻近”效应。活性中心的底物浓度一般是该溶液中的105倍。,例如碳酸酐酶催化的反应为：CO2 + H2O = HCO2- +H+ 该酶为单体酶，含有260个氨基酸残基。该酶的活性心含Zn2+，并与酶活性中心的三个组氨酸(His94，His96，His119)侧链
36、上的嘧唑基的N原子配位，而第四个配位体是H2O或羟基(Thr109)。,酸碱催化,溶菌酶的催化作用机理,4.共价催化,H-S-CH2-E,例如3-磷酸甘油醛脱氢酶的催化过程就 是共价催化作用：,-2H,又称为亲核催化(nucleophilic catalasis)或亲电子催化 (electrophilic catalysis)是具有非共用电子对的原子或基团，攻击缺少电子或具有部分正电性的原子从而形成一种不稳定的共价中间复合物，降低反应活化能，使反应加速。,微环境的影响,第七节 几种重要的酶概念,一、抗体酶(abzyme),具有催化作用的一类免疫球蛋白。,利用稳定的底物过度态类似物作抗原，对进行
37、免疫诱导产生的免疫球蛋白。,研究意义：,1.过度态类似物提供了探索催化机制模型； 2.它们能作为酶的特别强的抑制剂； 3.它们能作为抗原诱导产生广泛的新酶。,二、变构酶,机体内的酶有三种方式调节活性：变构调节；可逆的共价修饰；酶原激活。,(a11osteric enzyme),1.变构酶的概念、特点和性质,由于受小分子效应物结合，构像变化，活性明显得以调节的一类酶，称为变构酶。,变构酶特点：,活性中心结合底物并催化底物变化；,调节中心结合效应物或调节物，能引起亚基构象变化，进而影响催化亚基对底物的亲和力和摧话活性。,(2)酶分子具有底物结合的活性中心，也有与调节物结合的别构中心，这两中心可位于
38、同亚基不同部位，也可在不同亚基上；,(3)变构酶的动力学曲线不服从米氏方程式。它的v-s关系曲线呈S型。别构酶具有S型曲线的动力学性质，对于较小的底物浓度的变化，酶反应速度即可作出灵敏的应答。,(1)多亚基，具有四级结构；,一个效应物分子与变构酶的调节中心结合后，对酶分子催化底物变化能力的影响称为协同效应(cooperativeeffect)。当底物本身作用效应物，结合到调解中心后对酶活性的影响称为同促效应；如果效应物是底物以外的其它物质，当结合到调节中心，对酶活性产生的影响称为异促效应。,多数别构酶既能受底物的调节，也能受底物以外的效应物的调节，即兼具同促和异促效应。当酶结合效应物后，由于构
39、象发生改变，使得催化活性增高，这些别构酶称为正协同效应的别构酶。相反则称为负协同效应别构酶。所产生的效应分别称为正协同效应和负协同效应。,2.变构酶动力学,Koshland等人建议定量区别米氏酶、正协同效应酶、负协同效应酶标准：,米氏酶,正协同效应酶,负协同效应酶,序变模型(也称KNF模型，),一配体(效应物)结合到一亚基上，该亚基构象从T(方的)变成R(圆的)状态，这种转变会增加其余亚基对配体的亲和力，这叫序变模型。,1.对于任何亚基可以进入的构象有两种：T和R状态； 2.配基(效应物)连接到特别的亚基上，诱导并转变亚基构象； 3.在一个亚基中底物的结合引起构象变化，可增加或减少其余亚基对底
40、物的结合力。,3.变构酶作用机理,齐变模型(也称MWC模型),要点：1.蛋白质两种构象T和R相互转变。转变具有同时性，即蛋白质分子中的亚基要么全TT，要么全RR，没有中间杂交TR态。2.不利于配基的连接状态是T。全部松散有利于配基结合的是R状态；3.每一配基(或底物)的连接增加可能性：分子中亚基都成为R状态。即亚基变构是齐步进行的。,血红蛋白分子氧合过程变构行为更多通过其变模型。,天冬氨酸转氨甲酰酶，简称ATCase。它催化下列反应:,C,C,C,C,C,C,R,R,R,R,R,R,有催化活性构象,三、共价调节酶（共价修饰酶）,共价修饰方式： 磷酸化/脱磷酸化；（最常见的方式）甲基化/脱甲基化
41、腺苷酰化/脱腺苷酰化；糖基化/脱糖基,共价调节酶(covalent regulatory enzyme),也称为共价 修饰酶(covalent modification enzyme)。这是一类在 其它酶的作用下，其结构中共价结合或去除某个（些）基团 催化活性受到调节的酶。共价调节酶由于结构的变化造成构 象变化，催化活性也随之变化。,二聚体，此构象无活性,有活性,共价修饰举例：,四、同工酶,根据1971年国际生物化学学会生化命名委员会的建议： 同工酶是指同一种属中由不同基因或等位基因编码的多肽链 所组成的单体、纯聚体或杂交体；能催化相同的化学反应， 但其理化性质及生物学性质等方面都存在明显差异
42、的一组酶。,同工酶一般有两种或两种以上的业基组成。如乳酸脱氢 (LDH)是第一个被发现的同工酶。存在于哺乳类动物中的该 酶有H（心肌型）和M（骨骼肌型）两种。每个酶分子含四个 亚基，这样就有五种同工酶.,乳酸脱氢酶同工酶（LDH）PAGE结果,各种情况下，反应初速度与酶浓度关系,1.表示正常酶反应,2.底物浓度不够或不是酶反应初速度,3表明酶制剂中有可逆抑制剂,4.系统中有重金属离子等毒素或酶变性,5.空白对照不正确,练习2(自完成)：,磷酸果糖激酶提取过程中，测定了其中几个步骤的总活力及氮素含量见下表。计算出每个步骤的比活力、纯化倍数及回收率。,提示：纯化倍数=每次比活力/第一次比活力回收率
43、=每次总活力/第一次总活力,0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10,S,100%Vm,50%Vm,从动力学曲线简单判断酶属类。,米氏酶,正协同效应酶,负协同效应酶,例题1：现有碳酸酐酶110-6mol，测定得知每秒钟可以把CO2和H2O合成0.6molH2CO3。计算Kcat为多少。,Kcat=,110-6mol,=6105,例题2：,甘油醛-3-磷酸脱氢酶是四聚体，1个酶分子含有4个活性部位，酶的相对分子量40000。最适条件下5g纯酶每分钟催化2.8mol甘油醛-3-磷酸转变为3-磷酸甘油酸。试计算该酶的比活力和单位活性部位的转换数。,解：,酶的比活力单位定义为每mg蛋白所具有的活力
44、单位数。1活力单位是指在规定条件下，每分钟内转化1mol底物的酶量。因此：,2.8 1molmin-1 = 2.8(IU),二、核酶(ribozyme),具有催化活性的RNA。,从功能上分成两类：,1.剪切型核酶。,这类酶具有催化自身或者异体RNA的切割，相当于核酸内切酶。主要包括锤头型核酶、发夹型核酶、丁型肝炎病毒核酶和RNaseP。,2.剪切型核酶,这类酶主要包括组I内含子和组I内含子，实现mRNA前体自我剪接，具有核酸内切酶和连接酶两种活性。,研究较多的核酶是：(1)原核动物四膜虫的26SrRNA前体(6400nt)能够自我剪去内含子，拼接外显子，最后形成L-19RNA(含414nt)。(2)L-19RNA具有催化其它RNA分子发生多种分子间反应。,
