1、第四章抗菌药物的敏感性试验徐元宏,纸片扩散法 微量液体稀释法 E-TEST法,常用方法：,原理：将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼脂中水分溶解后不断向纸片周围扩散形成递减的梯度浓度，在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成无菌生长的透明圈即为抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关。,纸片扩散法（Kirby-Bauer法）,操作方法 ： 1.将在约56恒温的无菌M-H琼脂倾注直径为90mm的平板，其厚度 4mm。,2.无菌挑取孵育1624h的血平板上45个菌落。,3.置于无菌生理盐水中，校正其浊度
2、于McFarland No 0.5管。,4.用无菌棉签浸入细菌悬液中，将拭子在试管上壁轻轻挤压以挤去过多的菌液。棉签在三个方向均匀抹琼脂表面（每次转60）使菌液均匀分布，最后沿平板内缘涂抹一周。,5.盖上平板的盖子，放置培养箱内孵育，放置310分钟后贴上标准抗生素纸片。,6.根据选择的菌株挑选相应的抗菌纸片。肠杆菌科：氨苄西林、阿米卡星、哌拉西林/ 他唑巴坦、头孢噻肟、环丙沙星、亚胺培南、氨曲南、庆大霉素； 铜绿假单胞菌：头孢他啶、庆大霉素、哌拉西林、阿米卡星、环丙沙星、头孢吡肟、亚胺培南； 葡萄球菌属：头孢西丁、青霉素、红霉素、万古霉素、环丙沙星、庆大霉素、利福平 ；,肠球菌属：青霉素 、万
3、古霉素 、甲氧苄啶/磺胺异噁唑 、庆大霉素、环丙沙星、红霉素、氨苄西林 不动杆菌属：头孢他啶 、亚胺培南、阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦、头孢吡肟 、头孢曲松 、环丙沙星、米诺环素； 洋葱伯克霍德菌：头孢他啶 、米诺环素、甲氧苄啶/磺胺异噁唑 、美罗培南 ；,嗜麦芽窄食单胞菌：甲氧苄啶/磺胺异噁唑、左氧氟沙星、米诺环素 ； 嗜血杆菌属：氨苄西林、甲氧苄啶/磺胺异噁唑、头孢他啶、美罗培南、阿奇霉素、环丙沙星、头孢克洛； 淋病奈瑟菌：头孢曲松、环丙沙星、青霉素、大观霉素、四环素 ； 肺炎链球菌：红霉素 、苯唑西林 、甲氧苄啶/磺胺异噁唑、克林霉素、左氧氟沙星、四环素、万古霉素 ；除肺炎链球菌外的其他
4、链球菌：红霉素、青霉素、克林霉素、万古霉素、头孢曲松、左氧氟沙星。,7.用无菌镊子或纸片分配器将抗菌纸片粘贴于M-H琼脂的表面，一旦纸片贴上，不能移动；各抗菌纸片中 心距离应大于24mm，纸片距平板内缘应大于15mm。,8.经过351624h孵育。,9.取抑菌环直径，根据 CLSI（clinical and laboratory standardsinstitute ）标准，报告细菌对该抗生素敏感(susceptible,S)、耐药(resistant,R)、中介(intermediate,I)。,原理：聚乙烯板内含有各种稀释度的抗菌药物，实验时 加入100l浓度为105 CFU/ml的菌液，
5、盖上盖板，35 1620h观察结果。孔底部清晰不出现细菌沉淀的最低 抗菌药物浓度即为该抗菌药物对细菌的最小抑菌浓度， 通过CLSI标准判断其敏感和耐药。再取0.01ml容量接种 环取肉眼观察无菌生长的液体接种于血琼脂平板作次代 培养，经35过夜培养后观察最低抗菌药物浓度能杀死 99.9原始种入的细菌即为该菌的最低杀菌浓度(MBC)。,微量液体稀释法 (microdilution test),操作方法：1.抗菌药物的稀释和融解,2.抗菌药物母液的稀释,3.在微量聚乙烯微板孔中加入各种不同浓度的抗生素100l，从低浓度往高浓度加样，不需要更换吸管。,4.挑选1824小时的菌落置M-H肉汤增菌46小
6、时。,5.制备0.5麦氏比浊管，然后1:200稀释，使之最终浓度105 CFU/ml。,6.用微量加样器接种100l到96孔中，盖上盖板。 同时作阳性、阴性对照。,7.手工看浊度或仪器自动判读。按照CLSI标准报告细菌对某抗菌药物为敏感、耐药和中介。,原理：E试条是一条5mm50mm无孔试剂载体，一面 固定有一系列预先制备的浓度呈连续指数增长稀释抗 菌药物，另一面有读数和判别的刻度。抗菌药物的梯 度可覆盖有20个MIC对倍稀释浓度的宽度范围。将E 试条放在细菌接种过的琼脂平板上，经孵育过夜，围 绕试条明显可见椭圆形抑菌圈，圈的边缘与试条交点 的刻度浓度即为抗菌药物抑制细菌的最小抑菌浓度， 对照CLSI标准判断其敏感、耐药、中介。,E-TEST,1.挑取1620h的菌落 2.用无菌生理盐水制备成0.5麦氏比浊管浊度的菌液。,操作方法：,3.用无菌棉签浸入细菌悬液中，将拭子在试管上壁轻轻挤压以挤去过多的菌液。棉签在三个方向平均涂抹琼脂表面（每次转60）使菌液均匀分布，最后沿平板内缘涂抹一周。,4.用镊子将E-TEST试条的抗菌药物的一面贴向琼脂表面，有刻度的一面向外，直径140mm的平板可放置6条，9mm平板只能放置12试条 。 5.孵育，置平板于35孵育1624h。,6.孵育后形成一椭圆形抑菌圈，抑菌圈和试条的相交处的刻度即为抗菌药物对该菌的最低抑菌浓度(MIC) 。,
