1、饲料中沙门氏菌活菌的检测 EMA-PCR 法河南省地方标准编制说明一、 编制的目的和意义沙门氏菌（ Salmonella）是重要的食源性致病菌之一，同时还是一种人和动物的重要致病菌，主要通过肉类、奶类、蛋类等食品传播、感染人体，引发伤寒、败血症、急性胃肠炎等病症。据美国疾病预防控制中心的统计，在世界各国细菌性食物中毒病例中，沙门氏菌引起的食物中毒案例常列榜首或第二位。沙门氏菌是美国食物中毒致死的主要原因。美国每年全国大约报告40 000例沙门氏菌感染病例，但实际的感染人数可能要达20倍以上，因为许多轻型病人可能未确诊，据不完全统计，每年大约有1000人死于急性沙门氏菌感染。2012年10月17
2、日西双版纳州民族中学发生沙门氏菌感染引起学生腹泻事件，共造成151人感染。人的大多数沙门氏菌感染直接或间接地与动物性食品有关，而动物的沙门氏菌感染和带菌与所食用的动物性饲料中的沙门氏菌污染有直接关系。由于沙门氏菌很容易在自然环境及动物体内存活和增殖，而饲料原料（包括动物性及植物性原料）、饲料的粉碎加工及打包过程中操作不当都有可能引入沙门氏菌污染源，因此准确快速地检测饲料中的沙门氏菌，对于保障畜禽健康、食品安全以及维护公共卫生安全至关重要。目前沙门氏菌的检测方法较多，主要有传统的分离鉴定、免疫学方法以及分子生物学方法。我国目前采用的传统微生物学检测方法，疑似阳性结果的确认至少要5 d，费时费力而
3、且灵敏度很低，不适用于低度污染的饲料样品；免疫学方法存在检测限高和特异性不强等问题；分子生物学方法虽然快速灵敏，但不能有效区分死菌与活菌，而死菌DNA的存在容易导致假阳性问题。本研究以沙门氏菌侵袭蛋白invA为靶基因设计一对特异性引物，采用EMA与PCR结合的方法进行检测，能够有效地区分沙门氏菌的死菌与活菌，避免了因死菌DNA存在造成的假阳性结果，同时减去了传统培养方法中目标菌分离纯化的步骤，节约了大量检测时间。本次研究结果显示，PCR检测沙门氏菌的灵敏度在1.410 2 cfu/mL左右，从预增菌、样品处理、PCR扩增、凝胶电泳只需要48 h左右，与传统培养方法相比，稳定性好、灵敏度高、特异
4、性强，可用于检测饲料中沙门氏菌的污染状况，对饲料的安全监测具有重大意义。二、任务来源及编制原则和依据1、任务来源根据河南省质量技术监督局文件河南省质量技术监督局关于下达2017年第一批河南省地方标准制修订计划的通知（豫质监标发2017104号）的要求，由河南省兽药饲料监察所负责对河南省地方标准饲料中沙门氏菌活菌的检测EMA-PCR法（立项编号：20171210483）的起草、制定工作。2、编制原则符合国家法律、法规和政策，本着严格遵循科学依据，与国际水平接轨，并且准确、实用、快速的原则，开展了本次研究工作。3、编制依据主要依据以下标准：GB/T 13091 饲料中沙门氏菌的检测方法； GB/T
5、 28642 饲料中沙门氏菌的快速检测方法 聚合酶链式反应（PCR）法；GB 19489 实验室生物安全通用要求；GB 4789.28 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求。三、编制过程标准的编制过程分三个阶段进行：第一阶段：沙门氏菌活菌 EMA-PCR 检测方法的建立1.引物设计 参考已发表的文献，从 GeneBank 下载沙门氏菌 invA 基因序列。根据该基因中的保守且特异性序列，设计扩增 284 bp 大小的特异性引物对。表 1 引物序列引物序列 片段大小上游 5- GTGAAATTATCGCCACGTTCGGG -3下游 5- CATCGCACCGTCAAAGGAAC -3 28
6、4bp2. EMA-PCR 方法参数的优化 首先是探索沙门氏菌培养物的最佳致死方法和 EMA 最佳终浓度，分别采用煮沸裂解、紫外照射及化学方法对培养物进行处理，再分别加入 EMA，制备成 EMA 终浓度成梯度变化的菌悬液，采用卤素灯进行光照交联。然后通过离心收集上清液，进行 PCR扩增，观察凝胶电泳结果，选出最优的致死方法和最佳 EMA 添加终浓度。其次是最佳曝光时间的确定，在上述试验的结果上，选出最优组合，采用卤素灯下分别照射 0、1、2、4、6、8、10min，离心收集上清液，进行 PCR 扩增。3.确定方法的灵敏度和特异性。4. 用建立的沙门氏菌 EMA-PCR 方法检测饲料及饲料原料样
7、品，并与 GB/T 13091 饲料中沙门氏菌的检测方法和 GB/T 28642 饲料中沙门氏菌的快速检测方法 聚合酶链式反应（PCR）法进行对比，以验证该方法的实用性和准确性。第二阶段：沙门氏菌 EMA-PCR 检测方法应用实验 本阶段主要进行沙门氏菌EMA-PCR检测方法在河南省范围内的应用实验。为了进一步验证所建立的诊断方法的特异性、敏感性和实用性，由河南省兽药饲料监察所进行饲料样品检测应用试验。共对来自全国4个省（大部分样品来自河南省）共计216批饲料及饲料原料样品进行了应用检测；共检测出13批沙门氏菌阳性样品，并对沙门氏菌进行了分离鉴定。同时与GB/T 13091 饲料中沙门氏菌的检
8、测方法和GB/T 28642 饲料中沙门氏菌的快速检测方法 聚合酶链式反应（PCR）法进行了对比，检测结果显示，EMA-PCR方法检测结果与传统培养法GB/T 13091完全一致，但检测时间比传统培养法缩短了2-3天的时间；而按照GB/T 28642规定的普通PCR方法检出14批疑似阳性样品，经传统培养方法确认，最终阳性样品数为13批，表明该方法存在一定的假阳性率，需借助于传统培养法进一步确认。通过对比发现，EMA-PCR 方法具有准确、快速的特点，在应用推广方面具有一定的优势。第三阶段：标准的起草、修改与制定 根据以上实验资料及所有参与实验人员意见，在系统统计、科学分析的基础上，组织有关专家
9、起草了饲料中沙门氏菌活菌的检测 EMA-PCR 法河南省地方标准草案，规定了适用范围、样品处理方法、实验操作方法、结果判定等，并将标准草案送微生物有关方面专家征求意见，按照专家意见对标准草案进行多次修改完善，制定了当前的饲料中沙门氏菌活菌的检测 EMA-PCR 法（草案）。项目主持人：吴志明，河南省兽药饲料监察所，主持本项地方标准的制定与编写。主要起草人：吴志明：河南省兽药饲料监察所，负责标准的制定和技术推广。高延玲：河南省兽药饲料监察所，负责标准的制定、校订和技术推广。方忠意：河南省兽药饲料监察所，负责此标准校订及推广。董鹏：河南省兽药饲料监察所，负责标准的制定、校订和推广。李金磊：河南省兽
10、药饲料监察所，负责标准的校订。狄元冉：河南省兽药饲料监察所，负责标准的校订。四、主要内容的确定1. 检测方法基本原理EMA 能够穿过死细菌的细胞膜，在强光照射下可与 DNA 分子发生不可逆转的结合，使死细菌和游离状态的 DNA 不能作为模板进行 PCR 扩增。根据沙门氏菌的 invA 基因设计一对特异性引物，通过对样品进行 EMA 处理然后进行 PCR 扩增及凝胶电泳分析，含沙门氏菌活菌的样品会在 284 bp 处出现一条目的条带，而含有沙门氏菌死菌 DNA 及非沙门氏菌的样品不会出现该条带。2. 最佳致死方法、EMA 浓度及曝光时间向煮沸致死、紫外处理和异丙醇处理后的 0.5 麦氏单位 （M
11、CF）沙门氏菌菌悬液中分别加入 EMA，使其终浓度分别为 0, 0.5, 1, 2, 4, 8 g/mL，PCR 结果电泳图分别为图 1，图 2，图 3。由图可以看出煮沸法致死效果最理想，加入 EMA 终浓度为2 g/mL 既能完全抑制 0.5 MCF 沙门氏菌死菌的扩增。另向0.5 MCF 活菌菌悬液加入 EMA，使其终浓度分别为 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 g/mL，PCR 电泳结果如图 4。由图 4 可以看出加入终浓度为 20 g/mL 的 EMA 样品 PCR 电泳条仍无明显减弱，表明终浓度20 g/mL 的 EMA 添加量不会抑制沙门氏
12、菌活菌的扩增。图 1 煮沸处理注：M：Marker；1：阴性对照； 2：0 g/mL EMA；3：0.5 g/mL EMA；4：1 g/mL EMA； 5：2 g/mL EMA；6：4 g/mL EMA； 7：8 g/mL EMA图 2 紫外照射处理注：M：Marker；1：阴性对照； 2：0 g/mL EMA；3：0.5 g/mL EMA；4：1 g/mL EMA； 5：2 g/mL EMA；6：4 g/mL EMA； 7：8 g/mL EMA图 3 异丙醇处理注：M：Marker；1：阴性对照； 2：0 g/mL EMA；3：0.5 g/mL EMA；4：1 g/mL EMA； 5：2 g
13、/mL EMA；6：4 g/mL EMA； 7：8 g/mL EMA图 4 EMA 抑制沙门氏菌活菌浓度注：M：Marker；1：阴性对照； 2：0 g/mL EMA；3：2 g/mL EMA；4：4 g/mL EMA； 5：6 g/mL EMA； 6：8 g/mL EMA； 7：10 g/mL EMA；8：12 g/mL EMA； 9：14 g/mL EMA；10：16 g/mL EMA； 11：18 g/mL EMA；12：20 g/mL EMA向煮沸致死 0.5 MCF 的沙门氏菌菌悬液中加入 EMA，使其终浓度为 2 g/mL，黑暗环境下孵育 5 min 后，分别曝光 0, 1, 2,
14、 4, 6, 8, 10 min，处理后 PCR 产物电泳结果如图 5 所示。由图 5 可以看出只有不曝光的和曝光 1 min 的有条带，其他均无条带，说明 EMA 处理后，曝光 2 min，即可使 EMA 与死菌充分交联。图 5 曝光时间注：M：Marker；1：0 min； 2：1 min； 3：2 min；4：4 min； 5：6 min； 6：8 min； 7：10 min；8：阴性对照3. PCR 方法的敏感性用灭菌棉签蘸取新鲜培养的营养琼脂固体平板上的沙门氏菌菌落转接于 5 mL 灭菌去离子水中，用比浊仪调至 0.5 MCF，系列稀释至 10-1-10-8，以此为模板，按上述方法进
15、行 EMA-PCR试验，同时对检出的最低稀释度进行涂板计数，每个稀释度做3 个重复，37 培养 24 h，检测 PCR 反应灵敏度。结果表明，建立的 PCR 方法检测限是 1.4102 cfu/mL（图 6）。图 6 PCR 敏感性检测注：M：Marker；1：阴性对照； 2：10 8 CFU； 3：10 7 CFU；4：10 6 CFU； 5：10 5 CFU； 6：10 4 CFU； 7：10 3 CFU； 8：10 2 CFU；9：10 CFU；10：1 CFU4.PCR 方法的特异性将沙门氏菌标准菌株及其余待测菌株单菌落分别接种于 LB肉汤中过夜培养，取菌液作为 PCR 反应模板，按上
16、述方法进行试验。结果如图 7，由图可以看出以沙门氏菌标准菌株、甲型副伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌及肠炎沙门氏菌为模板 PCR 产物均出现 1 条特异性的 284 bp 条带，与预测序列片段大小相符；阴性对照、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、大肠杆菌等 11 株非沙门氏菌菌株未出现目的扩增条带；同时也未发现有其他非特异性扩增条带，表明建立的 PCR 方法具有很高的特异性。图 7 引物特异性检测注：M：Marker；1：阴性对照； 2：沙门氏菌；3：甲型副伤寒沙门氏菌；4：鼠伤寒沙门氏菌； 5：猪霍乱沙门氏菌； 6：肠炎沙门氏菌；7：志贺氏菌；8：福氏志贺氏菌；9：宋内氏志贺氏菌；10：
17、鲍氏志贺氏菌；11：金黄色葡萄球菌；12：大肠杆菌；13：单增李斯特氏菌；14：肠致病性大肠杆菌；15：肠产毒性大肠杆菌；16：肠侵袭性大肠杆菌；17：肠黏附性大肠杆菌5结果报告凡被检样品的 PCR 扩增产物电泳结果在 284 bp 处出现一条目的条带（见图 8），即可报告该样品中检出沙门氏菌。图 8 沙门氏菌活菌的 EMA-PCR 检测注：M：Marker；1：阴性对照； 2：沙门氏菌五、与国家法律法规和强制性标准的关系在标准的制订过程中严格贯彻国家有关方针政策、法律法规，严格执行强制性国家标准和行业标准。标准所确定的各项技术指标和内容与相关的基础标准相衔接，符合我国现行的有关方针政策，并与相关法律法规、标准吻合，遵循了政策性和协调同一性的原则。六、标准实施的建议该项技术标准的制定，试验数据充分，科学性强，并经过了大量实际应用，可作为河南省推荐性地方标准在饲料中沙门氏菌检测工作中进一步推广应用。
