1、ICS 65.120B 46 DB 41河 南 省 地 方 标 准DB 41/T XXXXXXXXX饲料中志贺氏菌活菌的检测 EMA-PCR 法（征求意见稿）XXXX - XX - XX 发布 XXXX - XX - XX 实施河 南 省 质 量 技 术 监 督 局 发 布DB41/T XXXXXXXXXI前 言本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由河南省畜牧局提出并归口。本标准起草单位：河南省兽药饲料监察所。本标准主要起草人：本标准参加起草人：DB41/T XXXXXXXXX1饲料中志贺氏菌活菌的检测 EMA-PCR 法1 范围本标准规定了饲料中志贺氏菌活菌的EMA-PC
2、R检测方法。本标准适用于饲料中志贺氏菌活菌的检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 4789.1 食品微生物学检验 总则GB 4789.28 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T 8381.2 饲料中志贺氏菌的检测方法GB/T 14699.1 饲料 采样GB 19489 实验室 生物安全通用要求3 原理叠氮溴化乙锭（EMA）能够穿过死细菌的细胞膜，在强光照射下可以结合死细菌DNA和游离状态的
3、DNA，使其不能作为PCR扩增模板。根据志贺氏菌的hly基因设计一对特异性引物，通过对样品进行EMA处理然后进行PCR扩增这一特定的DNA序列、电泳分离PCR产物，含志贺氏菌活菌的样品会在386 bp处出现一条目的条带，而含有志贺氏菌死菌及非志贺氏菌的样品不会出现条带。4 试剂和材料4.1 试剂除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，试验用水符合 GB/T 6682 一级水和三级水的要求。4.2 GN 增菌液。4.3 Premix Taq（2）缓冲液。 4.4 特异性引物(对) 序列为：a）上游引物：5-TTG CTG CTG ATG CCA CTG AGA-3；b）下游引物：5-CCA GAG
4、 GGA GAA CCA GTC CTT A-3。4.5 琼脂糖：电泳级。4.6 Marker 2000。4.7 志贺氏菌 ATCC 12022。4.8 50TAE 缓冲液。4.9 叠氮溴化乙锭（EMA）。DB41/T XXXXXXXXX24.10 溴化乙锭（EB）。4.11 无菌均质袋。4.12 灭菌离心管：1.5 mL，15 mL。5 仪器设备5.1 PCR 仪。5.2 天平：感量 0.01 g。5.3 电热恒温培养箱。5.4 离心机：离心转速在 12 000 r/min以上。5.5 浊度仪。5.6 卤素灯：功率 500 W。5.7 核酸电泳仪。5.8 凝胶成像系统。5.9 微量移液器：0
5、.5 L10 L，10 L100 L，100 L1000 L，1 mL10 mL。5.10 制冰机。5.11 拍击式均质器。6 样品采集与制备按GB/T 14699.1的规定采样，将样品充分混匀后密封低温保存，注意整个过程不要将样品人为污染。7 检验步骤7.1 增菌取试样25 g，加入装有225 mL GN增菌液的均质袋中，在拍击式均质器中拍打混匀2 min，于36 培养6 h8 h。如果试料量不足25 g，试料质量与增菌液的体积比应为1:9。7.2 模板的制备取1 mL增菌液到灭菌离心管中，12 000 r/min离心2 min，弃上清，加入1 mL 灭菌去离子水悬浮离心2 min，弃上清，
6、再加入1 mL 灭菌去离子水悬浮离心2 min，弃上清。向离心管中加入0.2 mL灭菌去离子水悬浮，调节菌悬液浓度至0.5麦氏浓度（MCF），取0.2 mL菌悬液到灭菌离心管中，加入终浓度为0.5 g/mL的EMA，置黑暗环境下孵育5 min，再将离心管置于冰上，在卤素灯下照射1 min后沸水浴10 min，将离心管迅速转移至冰浴中使其迅速冷却，用涡旋仪混匀裂解物，12 000 r/min离心2 min，收集上清液，作为PCR扩增的模板（模板制备可选用等效的商品化试剂盒）。分别设志贺氏菌阳性标准菌株为阳性对照，不含志贺氏菌的样品为阴性对照。7.3 PCR 扩增采用50 L反应体系：Premix
7、 Taq 缓冲液25 L，模板5 L，浓度为20 mol/L的上、下游引物各1 L，灭菌去离子水18 L。DB41/T XXXXXXXXX3反应程序为：95 预变性5 min，35个循环：95 变性30 s，60 退火30 s，72 延伸40 s；72 终延伸5 min后 4 保存。7.4 电泳称取1.5 g 琼脂糖加入100 mL 1TAE电泳缓冲液中，微波炉加热使其充分熔化，冷至65 左右，加入5 L溴化乙锭，充分混匀，根据需要在模板内放入合适的梳子，倒入凝胶制成约5 mm厚的胶块。在电泳槽中加入适量1TAE缓冲液，使液面没过凝胶2 mm 左右。取PCR扩增产物5 L8 L（需与上样缓冲液
8、混合）加入到上样孔内，设Marker 2000对照。5 V/cm 8 V/cm恒压下电泳20 min30 min。电泳结束后，将琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪中观察结果。8 结果判定8.1 结果分析条件设定试验结果成立条件，志贺氏菌阳性对照的PCR产物，经电泳后在386 bp位置出现扩增条带，同时阴性对照PCR产物电泳后没有任何条带，则检测试验结果成立，否则结果不成立（参见附录A）。8.2 阳性判定如果样品的PCR产物电泳后在386 bp的位置上出现扩增条带，判定25 g（mL）样品中检出志贺氏菌活菌。8.3 阴性判定如果样品的PCR产物电泳后在386 bp的位置上未出现扩增条带，判定25 g(mL）样品中未检出志贺氏菌活菌。DB41/T XXXXXXXXX4A A附 录 A（资料性附录）志贺氏菌活菌 EMA-PCR 扩增电泳图志贺氏菌活菌EMA-PCR电泳图参见图A.1。图 A.1 志贺氏菌活菌 EMA-PCR 扩增电泳图说明：MMarker 2000 1阴性对照2阳性对照_
