1、cDNA 的合成实验原理和操作步骤一、实验目的掌握植物 cDNA 合成的原理和方法二、实验原理反转录酶主要用于体外 cDNA 的合成。目前最常用的反转录酶(reverse transcriptase) 有SuperscriptII、 M-MLV 和 AMV 等。它们具有依赖于 RNA 或 DNA 的 DNA 聚合酶活性和RNaseH 酶活性，可以以 RNA 分子为模板，合成出一条 DNA 链。形成的 DNA 是与 RNA模板互补的，因而反转录产生的 DNA 分子称之为 cDNA。三、实验材料、器具及药品 植物总 RNA 溶液。 紫外分光光度计、离心机、冰盒、口罩、手套、EP 管架、超净工作台、
2、移液器、DEPC 处理过的枪头、EP 管等。 5M-MLV RT Buffer、 2.5mM dNTP mix 、 RNase 抑制剂(30U/L)、M-MLV Reverse Transcriptase、 Oligo(dT)18 primer、无菌的 DEPC 水等。四、实验步骤注意：戴手套进行以下操作，严防 RNase 污染。1在超净工作台上吸取 1ml 无菌水到 EP 管中, 加入 2l 植物总 RNA 溶液,充分混匀，在紫外分光光度计上测定 260,280nm 的光吸收值(OD 值),然后计算 RNA 的浓度,并分析其纯度。分光光度（紫外吸收）法（1）预热紫外分光光度计 1020 分钟
3、。 （2）取两只比色杯，一只装入 1ml H2O 溶液，作为空白溶液，用来校正分光光度计零点及调整透光度至 100。（3） DNA 纯度及浓度测定： 取 2ul DNA 或 RNA 样品加入另一比色杯，加 dH2O 至 1000ul, 混匀。 将两只比色杯置分光度计中，调入射光波长，分别用空白溶液调整零点（T 为 100，OD为 0），测定待测样品液在 260nm、280nm、230nm 的 OD 值。 计算浓度：对于双链 DNA 1.0 OD260=50ug/ml, 对单链 RNA1.0 OD260=40ug/ml。测定纯度： v 纯的 RNA 溶液其 OD260/OD280 的比值应介于
4、1.7 至 2.0，OD 260/OD230的比值应大于 2.0。 RNA 样品 OD260/OD280 的比值太小，说明有蛋白或苯酚污染。比值大于 2.0，则可能被异硫氰酸胍污染。 OD260/OD230 的比值小于 2.0 时表明有小分子及盐存在。 纯的 DNA 溶液其 OD260/OD280 应为 1.8，OD 260/OD230 应大于 2.0。OD260/OD280 大于 1.9 时，表明有 RNA 污染，小于 1.6 时表明有蛋白质或酚污染。 OD260/OD230 小于 2.0 时，表明溶液中有残存的盐和小分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。2在 DEPC 处理过的 Ep 管中加入约 4g 总 RNA 和 1l 0.5g/l 的 Oligo(dT)18 primer,小心混匀, 70保温 5 分钟,立即浸入冰水中。3按次序分别加入下列试剂：5l 5M-MLV RT Buffer2l dNTP mix(2.5mM) 1l RNase 抑制剂(30U/L) 1l M-MLV Reverse Transcriptase 然后加 DEPC 水到 25l.4 小心混匀，室温离心 5 秒，将所有溶液收集到管底， 37保温 1 小时。 5 90处理 5 分钟，冰上冷却。 6 用于 PCR 扩增或-20 保存备用.
