1、1金线莲组织培养的发展状况10 级农学 3 班 102250002053 魏永焘摘要：被称为“药中之王”的金线莲属名贵中草药,野生数量极少,通过人工栽培形成规模生产, 才能满足市场需要。本文对珍稀中草药金线莲的组织培养方面作了综述，为深入研究和合理开发利用金线莲提供参考关键字：金线莲，组织培养，培养基金线莲（An0ect0chilus r0xburghii）即花叶开唇兰，别名金蚕、金线兰、金石松、金线虎头蕉、金线入骨消等，是兰科开唇兰属的一种多年生草本植物。金线莲是我国传统的珍贵药材，有清凉解毒，滋阴降火，消炎止痛之功效。对无名肿痛、发烧、止泻、蛇伤均有显著疗效，且无毒副作用，使用安全。金线莲
2、株型小巧，叶型优美，叶脉金黄色，呈网状排列，是观赏价值极高的室内观叶珍品 1。金线莲在我国主要分布于亚热带地区，即福建、广东、广西、浙江、江西、海南、云南、四川、贵州以及西藏南部等省区 2，金线莲的花期在福建一般为 9 月中旬至 11 月上旬，开花时间多在午夜，气温 2225、相对湿度 86%95%时开花多，高地比低处开花早，后开的花不稔 3，近年来，金线莲在治疗高血压、糖尿病及肿瘤等疑难病症方面，日益引起医药界的重视。金线莲在福建、台湾等省和东南亚地区被视为珍稀名贵药材，特别在台湾省更是倍受青睐，被称为“药中之王” 4. 随着研究的深入，金线莲的优良品质突显，日益受到世人青睐，具有广阔的开发
3、利用前景 5。1 外植体的选择与处理1.1 外植体的选择冯亦平等采用以金线莲试管苗的叶、茎段和茎片(厚约 2mm)为外植体,对金线莲组织培养快繁技术进行研究。结果表明,茎片是其快繁的最佳外植体, 6。段玉云,曾黎琼,程在全等经过实验证明采集长势良好、无病虫害的野生金线莲植体,以金线莲幼嫩茎段为外植体，取回后置阴凉大棚内培养 1 星期左右，其所带的杂菌最少 7。江建铭等取生长健壮、无病虫害的植株,去叶后放入低浓度的洗衣粉水中漂洗 35min, 然后用流水冲洗 30min。在超静工作台前,用 75%酒精湿润 56s,放入 0.1 %的 HgC 溶液灭菌 1213min,用无菌水冲洗 56 次。将消
4、毒好的茎按上段(具茎尖)、中段和下段(匍匐茎段) 切成长约 1.52cm,带有 12 个节间的小段,分别接种于 M S+6-BA4.0mg/L+NAA0.4mg/L 培养基上, pH5.6,蔗糖 2.5%,琼脂 0.7%。培养条件为:温度(25) ,光照时间 12h/d,光照强度 1500 2000lx。实验表明,外植体茎段的分化程度对诱导结果存在一定的影响。上、中段茎均能萌动生长。上段茎因有顶芽的存在,顶端优势表现较为强烈,因而以生长为主,不定芽发生较少,平均芽增殖数为 0.6 个;中段茎不定芽发生快、量大、长势好,平均芽增殖数为 4.05 个,并形成多枝丛生状。下段茎由于组织相对老化,虽有
5、不定芽发生,但发生量与生长势均较弱 8。这和陈自力 9报道的结果一致。1.2 外植体的消毒吴艺东经过实验证明先将金线莲用流水将植株洗净后去掉根、叶, 再用小刀把叶鞘及顶芽外叶削掉, 整个过程不要伤及腋芽。用棉花沾肥皂水擦洗植株并浸泡 10 min 后用纱布包起, 移至超净工作台上的消毒效果最佳 10。黄慧莲等经过实验认为用 75%酒精振荡 10 215s 后, 再用 0.1%升汞水(氯化汞 )灭菌 8-10m in , 无菌水冲洗 3-4 遍。最后用 12%漂白粉澄清液灭菌 10 min , 无菌水冲洗 5 遍后即可进行接种杀毒效果最佳 11。黄德贵等采用以台湾金线莲为种苗，剪取株高 6 -1
6、0cm，顶芽较稳定的植株上半部，流水冲洗干净，切去叶鞘及顶芽外叶，在肥皂水中擦洗，浸泡 l0 分钟。后流水冲洗 10 分钟，在超净台上，先用 75酒精浸泡 l0 秒钟，无菌水冲洗 3 次。后接不同的消毒药剂及不同的消毒时间进行消毒。消毒后用无菌水冲洗，然后剥去包裹在顶芽的幼叶。接种后至 60天间调查供试的污染率、变褐率、芽萌动率。试验结果表明，金线莲以顶芽为外植体，用0.1升汞浸泡 3 分钟，再经 12漂白粉液 10 分钟的双重消毒。其材料污染率为零，芽萌动率为 85 12。2 培养基的筛选2.1 金线莲初代培养基的筛选黄碧华利用大量元素试验:基本培养基设 1/2MS、MS 、分别记为 A1、
7、A2 。植物激素试验:为诱导腋芽发生,采用 6-BA、NAA,分别记为 B1、B2(1.0mg/L 、2.0mg/L)和 C1、C2(0.1 mg /L、 0.2mg /L)。20d 后观察其生长情况。统计 30d 时各处理的萌芽率 (% ), 生长健壮且无病虫害的观赏金线莲幼嫩茎尖接种于初代培养基上,经过 20d 左右的培养, 实验表明茎尖切口处开始膨大,可见黄白色的小芽,到 25d 左右,黄白色的小芽逐渐转为黄绿色。统计 30d时各处理的萌芽率(% ), 处理 3 组的培养基较高较差,萌芽率只有 70.2%。在处理 4 组的培养基是较理想的组合,得到最适的培养基为 MS+6-BA2.0mg
8、 /L+NAA0.02mg /L,其平均萌芽率达 93.3%13。2.2 金线莲继代培养基的筛选冯亦平等经过实验证明诱导金线莲产生愈伤组织的适宜培养基是: MS(大量元素减半, 微量元素加倍) +6-BA 4.0mg/L+ZT 0.2mg/L+NAA 0.5mg/L+0.7%琼脂+3%蔗糖; 适合不定芽分化的培养基是:MS+6-BA 4.0mg/L+NAA 0.3mg/L+0.7% Agar+3%蔗糖 6。高燕，白燕冰，赵云翔利用金线莲无菌苗分化出的丛生芽分割转接到继代增殖培养基上培养基 Ar + 6-BA l4 mg/L +NAA 0.10.8 mg/L + I B A 0.2 mg/L +
9、KT 0.5 mg/L .培养基附加糖 3 、琼脂粉 0.7 ，pH5.8 。通过改变 B A 和 NAA 的浓度， 共为 7 个处理(每个处理接种三瓶， 每瓶 5 个接种块 )，进行继代增殖培养。试验结果：培养 l 5 d 时，7 种处理有的开始分化出不定芽，60 d 后 7 个处理中以处理 BA2.0 + NAA0.4+ I B A0.2+ K T0.5 为最佳，分化出的不定芽为丛生状，且多达 90 个小芽，生长粗牝，分化率达 l00，增殖倍数 6。其次是处理 BA 2.0 + NA A0.2 + IBA0.2+ KT0.5，不定芽总数 81 个，生长粗壮分化率 l00，增殖倍数 5.4。
10、而另 5 个组合的不定芽分化率和增殖倍数分别是87、3.5，93、4，87、3.7，80、3.6 和 93、3.8。试验表明，芽的分化和增殖与BA、NAA 浓度有密切关系，一定量的 B A、 NAA 对不定芽有促进分化和增殖的作用 14。刘伟等以金线莲组培苗的茎段和顶芽为外植体进行增殖培养,在光照时间 12 h /d ,光照强度 1200 lx ,温度(25 ) , pH 值为 5.8 培养条件下比较不同基本培养基、细胞分裂素、生长素、添加物等因素对金线莲生长状况的影响。实验结果表明通过对不同培养基的培养效果进行对比分析后筛选出适宜的培养基分别是:生芽增殖最佳配方为 MS+ 琼脂 7g/L+
11、蔗糖25 g /L + NAA 0.2mg/L+ 6 BA 2mg/L 。结果表明添加马铃薯、香蕉、蛋白胨、花宝一号、活性炭等添加物能显著地促进金线莲外植体的分化与生长 15。2.3 金线莲壮苗培养基的筛选高燕，白燕冰，赵云翔利用将幼苗转接到壮苗培养基上，培养基 Ar 加入或不加入l0马铃薯、l0香蕉等添加物+糖 3+ AC0.2；培养基均加入琼脂粉 0.7，pH5.8 。试3验设培养基中添加 10马铃薯，添加 l0香蕉，添加 l0马铃薯 +10香蕉，不添加马铃薯和香蕉(对照)等 4 种处理，将幼苗转接到生根培养基上。培养 60d 后的观察结果表明：在处理 IBA 0.5 +NAA0.5 和处
12、理 IBA0.5+NAA1.0 的两种培养基上， l2d 后开始生根，60d后不定根的生根率达到 l00。平均每株苗的根数 3.8 条或 4.0 条，不定根平均伸长 2.8cm或 3.1cm，苗生势粗壮，生长最好；可以看出，一定量的 IBA 和 NAA 对不定根的诱导有促进作用 14。陈汉鑫,王雅英,杨忠耿等设置了不同激素组合的培养基. 分别为含有 1 个节, 长约 1. 0 cm 的茎段和含有顶芽长约 1.0 cm 的节段接种于 18 种培养基中。不同激素组合的培养基对茎段、 顶段丛生芽诱导的影响。由实验可知,不同激素组合的培养基在相同时间内,诱导茎段、 顶芽产生丛生芽的能力不同.。其中基本
13、培养基为 MS 的比基本培养基为 1/ 2MS 的对茎段诱导丛生芽的能力强, 而对顶芽诱导丛生芽的能力反而弱。在比较 18 种培养基诱导茎段、 顶芽产生丛生芽的能力后,可知 MS 为基本培养基 , BA 1.5 mg/ L, NAA 0.15 mg / L 的组合为诱导茎段的最佳组合 . 1/ 2MS, BA 1. 0 mg / L, NAA0. 25 mg/ L 的组合为诱导顶芽的最佳组合 16。 冯亦平,张利平,王岩花等将茎片诱导形成的愈伤组织接种于分化培养基上,约 60 d 后,分化出丛生小苗。经过实验可知: 6-BA /NAA 的比值是影响丛生芽分化的主要因素, 随着 6-BA /NA
14、A 比值的增大,丛生芽的数目越多,平均苗高增加, 直到 6-BA /NAA 为 4 . 0 /0 . 3 时达到最佳, 30 个愈伤组织分化产生 750 个不定芽,平均苗高达 2 . 7 c m, 且多数不定芽健壮、 生长旺盛, 质量较好。实验数据表明, 高浓度的 6-BA 不利于丛生芽的形成。因此, 诱导茎片分化的最适宜培养基是: MS+6-BA4.0mg/L+NAA0.3mg /L+0.7% Agar+3%蔗糖 17。刘伟等以金线莲组培苗的茎段和顶芽为外植体进行增殖培养,在光照时间 12 h /d ,光照强度 1200 lx ,温度(25 ) , pH 值为 5.8 培养条件下比较不同基本
15、培养基、细胞分裂素、生长素、添加物等因素对金线莲生长状况的影响。实验结果表明通过对不同培养基的培养效果进行对比分析后筛选出适宜的培养基分别是:壮苗培养基为 MS+琼脂 7g/L+蔗糖 25g/L+ 蛋白胨 2g/L +花宝 1 号 3g/L+香蕉 100g/L+活性炭 1 g/L 和 1/2MS+琼脂 7 g/L+蔗糖 25 g/L +蛋白胨 2 g/L+香蕉 100 g/L+活性炭 1 g/L15。3 金线莲的增殖 3.1 芽的诱导陈振东等设立四个实验：（1） 、两种培养方式试验对芽分化的影响。培养基为 1/2 MS +BA 4 +NAA 0.5，pH 5.8。固体培养为琼脂 0.8；（2）
16、 、三种基本培养基成分效用比较。设 MS 1/2 MS、减量 MS( MS 所有化合物用量减半) 三种。添加 BA 4、NAA 0.5 ，蔗糖 3；（3） 、添加不同激素、有机物及水质试验。基本培养基为 1/2 MS。设掭加不同种类的激素、有机物、糖类、水等，并以不添加生长素的培养基作为对照。 （4） 、固体 1/2 MS培养基添加 BA 与活性炭不同浓度的培养效果。每处理接种 16 个茎段。实验结果表明，用金线莲节段为培植体，经培养能大量快速繁殖这种嵩危药用檀物的种苗。节段的腋芽分化过程中，有腋(侧)芽萌生和原球茎增殖两途径。固体培养基培养一个节。经 3 个月侧芽再生。其最高的繁殖倍率平均可
17、达 5.1 倍。不同的金线莲品种繁殖速率不同，广西、福建金线莲增殖速率为高。固体和液体浅层培养的效果相同。使用 MS 基本培养基对芽繁殖倍率比 1/2MS、减量 MS 培养基提高了 23.3、51.5。激素 BA 对芽的增殖有极显著的促进作用。添加 BA 5ppm、NAA 05 或 0.3 ppm 的激素浓度组台为茸增殖诱导最佳配方 18。段玉云等用解剖刀将金线莲无菌苗带腋芽的茎段切下，接种在培养基(芽诱导培养基：MS+6-BA 3 mgL-1(单位下同)+NAA 0.2+CH(水解酪蛋白) 300；) 中培养。15 后，茎段开始膨大，茎节间的腋芽渐渐突起并伸长。25d 后，腋芽生长良好，有的
18、基部又长出新芽。将4上述芽苗从原茎段上切下，转接到增殖培养基(增殖培养基：MS+6-BA4+NAA 0.1+CH 300；)中进行培养。2 个月后，形成丛生的小苗，平均达 9 个。将丛生芽剪下放置于相同的培养基上进行继代培养，即可不断地得到大量丛生小芽 7。黄德贵等采用以台湾金线莲为种苗，分别切取长约 lcm 的顶芽或具节的茎段为外植体，接种到以 Ms 之大量元素减半，其他成分不变的 l2MS 培养基， 附加 BA5ppm(以下单位同)，NAA0.5 ，蔗糖 3，琼脂 0.8，pH 5.8 每支试管接种一个外植体，培养温度为 2 53，日光灯光照 l 0 个小时，光照强度 10000-1500
19、Lux,实验结果表明顶芽培养在含 ZT 0.1ppm，BA 5ppm，NAA 1ppm 的 1/2 MS (大量元素减半。其他成分不变)培养基中，芽诱导效应最佳，可诱导出芽数达 4.88 个，生长良好 10。3.2 壮苗及诱导生根 陈汉鑫,王雅英,杨忠耿等设 7 个处理，以未添加 ABT 为对照，ABT 用 1 号和 3 号两种型号，每个型号各设 1、2.3mg/L 三个浓度。基本培养基为 MS +NAA 3.0mg/L（单位下同）+ IBA1.0+KT0.2，活性碳 0.3%，蔗糖 3%，琼脂 0.65%，pH5.8 。每处理接种苗 10 瓶，每瓶 6 株，三次重复。在光强 1500lx，温
20、度 25，接种后每 15d 调查一次，每瓶固定观察 3株，记录苗高、叶片数和生根状况。实验证明在光强 1500lx，温度 25，pH 5.8 最有利于苗的长壮 19。 黄德贵等以台湾金线莲及福建、广西金线莲为组织培养的增殖苗或植株。设立以培养基加 NAA 与活炭对培植体生长及生根的影响。供试品种为台湾金线莲。选取增殖培养苗高 3.5-6 厘米的幼苗，切取具顶芽、2-3 个节、有 3-4 片叶( 含小叶，下同) 、高 3-4 厘米的材料作培植体，以 1/2 MS(MS 大量元素减半，其他成份不变，下同 )为基本培养基。设添加 NAA 1、2 、3 、4 、5 ppm(单位下同)五个浓度：活性炭设
21、不加与添加 0.3浓度，组合配方 10 个。蔗糖 3，pH 5.8,固体培养。每瓶接种一个培植体，每配方接种 10 个。重复 3 次。接种后记录每株生长状况。培养后每月调查生长状况一次。培育 183 天调查每株净增加的叶片数、节数、高度、生根数及最长根的长度，并进行方差分析。本试验表明，以增殖培养的苗。切割成有 2-3 节，叶片 3-4 片、高 3-4 厘米长的茎顶节段为材料。经培养6 个月。培植件每株平均净增高 6.9 厘米、叶 3.63 片、根 3.92 条：切取有小叶 2-3 片、高2-3 厘米、无根的小芽苗，经培养 3 个月，培植体株平均可净增高 3.38 厘米、叶 3.29 片、根
22、2.5 条，鲜重达 0.5 克。结果表明 NAA 4ppm，活性炭 0.3 的组合，对金线莲试管苗快速生长和生根有明显促进作用，是较佳的壮苗生根方法 20。4 产地，光照强度、温度对金线莲生长的影响 不同产地外植体对在相同培养上对金线莲原球茎诱导率有明显差异，以广西野生金线莲的诱导数最多，福建野生金线莲诱导数次之，台湾的金线莲不能诱导出原球茎，提示用作组织金线莲原球茎的诱导率的外植体与不同生态条件下形成的遗传基因密切相关 21。吴坤林报道光照强度对金线莲的生长发育的影响较明显，在低光强度下金线莲组培苗表现为徒长，纤弱，在 20003000Inx 光强下生长旺盛，叶面积茎径适中，符合金线莲商品的
23、质量标准，当光强大于 4000Inx 时伸长生长受抑制，苗较矮壮，叶片较大 22。在 333。 C 高温条件培养，对不定芽组培苗的生长一开始就受抑制，然后叶片逐渐枯萎，接着顶芽枯萎，最后整个植株枯萎死亡。将叶片全枯或顶芽枯萎的植株，转换或不转换培养基，放至适宜培养温度下，顶芽未受损的植株能继续伸长，恢复生长，顶芽已干萎的，则下部节上的腋芽会较快地萌发生长 23。金线莲组织培养苗移植成活率的高低主要取决于基质以及移植 1 个月内的小气候温度和光照条件，当移植基质为等量珍珠岩，河沙、垃圾泥，气温 253。 C，空气相对温度为 90以上，光强为 l0001nx，光照时间 1 日101 2 mi n，
24、组培苗成活率可超过 90。试验结果还表明金线莲茎段愈伤组织诱导分化丛5生 芽和丛生芽壮苗促根需要低光照， 高温度和温度适 中的培养条件 24。5 小结植物基因工程在植物遗传育种中占有越来越重要的地位, 在这个过程中植物组培技术是非常重要的一环, 观赏金线莲以带芽茎段作为外植体较容易诱导腋芽的萌发生长, 建立起了相对稳定高效的组培体系,通过继代培养可在短时间内大量增殖。分析结果表明:1.观赏金线莲最佳启动培养基为 MS + 6 BA 2.0mg/L+ NAA 0.2mg/L,其平均萌芽率达 93.3%; 2.最佳的促进侧芽增殖的组合是 MS+ 6 BA 3.0mg /L+ NAA 0.1mg/L
25、 , 其繁殖系数达 6.0;3.基本培养基、BA 、NAA 和活性炭对观赏金线莲根的诱导效果都极显著 ,1/2MS+ IBA 1.5mg/L+NAA 1.5mg/L+活性炭 0.5mg /L 为诱导生根的最佳组合。植物组织培养技术在金线莲的培养上的应用还有待进一步研究。参考文献：1 范子南,等. 金线莲的组织培养研究J. 福建师范大学学报 , 1997,13(2): 82-87.2 中国科学院植物研究所. 中国高等植物图鉴( 第五册) M. 北京: 科学出版社, 1980. 3 陈裕,等. 金线莲的开花特性J. 亚热带植物通讯, 1996, 25(1): 35-37.4 郑纯,等. 金线莲文献
26、考证、原植物及商品调查J. 中草药, 1996,27(3): 169-1715 郑纯.金线莲文献考证、原植物及商品调查J. 中草药,1996,27(3): 169-171.6冯亦平,张利平,王岩花等.金线莲外植体的筛选及不定芽诱导的研究 J.种子.2009.10(28):19-22.7 段玉云,曾黎琼,程在全.台湾金线莲的组织培养与快速繁殖 J.植物生理学通讯,2005,41(2):1988江建铭, 俞旭平, 沈晓霞等.金线莲组培快繁技术研究J.时珍国医国药,2009,20(2);408-4109陈自力.花叶开唇兰组织培养快速繁殖的研究J .林业勘察设计 2003 , 23(2): 46 .1
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