1、血清总蛋白的测定及白球的含量比,双缩脲法和溴甲酚绿法小组成员：付德华 程耀锋 万育林 黄亚 赵维琦,血液血浆血清,血液包括血浆和血细胞 血浆是血液的重要组成部分，为淡黄色液体 血清为血液凝固后，在血浆中除去纤维蛋白后得到的淡黄色透明液体,总蛋白测定及白蛋白测定,实验目的： 熟悉血清蛋白的测定方法（双缩脲法）。 掌握血清总蛋白测定的临床意义。 进一步巩固掌握721E型分光光度计的使用。 熟悉血清白蛋白的测定方法（溴甲酚绿法）。 掌握血清白蛋白的测定和白蛋白和球蛋白的含量比（A/G）测定的临床意义。,实验原理,（总蛋白）双缩脲法的原理：双缩脲在碱性环境中，能与硫酸铜结合成紫色的化合物，此反应称为双
2、缩脲反应。,蛋白质分子中含有肽键与缩脲结构相似，故也能进行此反应。反应生成紫红色配合物在540nm处有明显吸收峰，吸光度在一定范围内与蛋白质的含量成正比关系，故双缩脲反应可作为蛋白质测定的依据。 双缩脲反应并非是蛋白质特有的颜色反映！ 凡分子内含有2个或2个以上甲酰基氨基（-CONH2-）均可呈双缩脲反映。,凯式定氮法,测定化合物或混合物中总氮量的一种方法，即在催化剂条件下，用浓硫酸将有机氮转化为无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，然后用过量的酸液吸收用标准碱滴定，这样就可以算出样品 中的总 氮量。由于一般氮元素质量占蛋白质质量的 16% ，故样品中蛋白质含量=含氮量*6.25,实验试剂
3、,生理盐水：NaCl 0.9g 溶于100ml蒸馏水 双缩脲试剂：硫酸铜 3.0g溶于500ml蒸馏水，加酒石酸钾钠9.0g,碘化钾5.0g，完全溶解后，加入24%NaOH100ml，用蒸馏水稀释到1L，置聚氯乙烯瓶内盖紧保存。 蛋白质标准液：收集混合血清，经凯氏定氮法定值，用作蛋白质标准液。贮于冰箱中备用。也可用100mg/ml牛血清白蛋白替代。 待测血清用生理盐水1:10稀释。,实验操作,取3支试管，按下表操作。,混匀，37水浴放置10分钟，以空白管调零点，在540nm波长处进行比色，分别读取各管的吸光度。 计算公式（P65）,实验原理,白蛋白具有与阴离子染料结合的性质，在PH=4.2的环
4、境中，带正电荷的白蛋白（PI=4.9）与阴离子染料溴甲酚绿（BCG）结合，由黄色变成蓝绿色。蓝绿色的深浅与白蛋白的浓度成正比，在波长620纳米处有光吸收峰。因此，应用BCG法可以直接测定血清白蛋白的含量。试剂中加入非离子型表面活性剂,可提高蛋白质与染料的结合力和溶解度。,试剂,1.溴甲酚绿（BCG）贮存液 取BCG 419mg，用10ml 0.1mol/L NaOH溶解，加NaN3 100mg ，定容至1000mL。贮于棕色瓶备用。如用溴甲酚绿钠盐应称取432mg.加水溶解。 2.0.1mol/L柠檬酸缓冲液（pH 4.2）分别配制0.1mol/L柠檬酸和柠檬酸钠溶液，然后按12.3：7.7的
5、体积比例混合。每1000ml混合液加入NaN3 100mg。 3.30%聚氧化乙烯月桂醚(Brij-35)溶液 取Brij-35 30g,加少量水，60水浴溶解，加水至100ml（此可用Tween-20或Tween-80代替)。 4.BCG应用液 BCG贮存液250ml，0.1mol/L柠檬酸缓冲液（pH4.2)750ml,30%Brij-35 8ml(也可以用Tween-20 8ml或Tween-80 10ml代替）混合而成。 5.标准蛋白溶液（10mg/ml) 称取人白蛋白1.00g，用生理盐水,1.白蛋白标准曲线绘制取4支试管，按下表稀释标准液：,注意事项,1.由于各种血清蛋白质的分子量
6、不同，故其浓度不宜用mol/L表示。 2.双缩脲试剂中酒石酸钾钠的作用是络合铜离子，以维持铜离子在碱性溶液中的溶解性；碘化钾能防止两价铜离子还原 3.高脂，黄疸及溶血标本应作清空白对照来校正误差。含脂类极多的血清，加入双缩脲试剂后会出现混浊，可用乙醚3ml抽提后再进行比色 4.血清白蛋白浓度100g/L时，需作稀释处理，结果乘上稀释倍数,2. 血清白蛋白测定,用生理盐水按1：10的比例稀释血清，取稀释后的血清0.2ml加入BCG应用液 5.0ml混匀后立即同上比色，读取光密度，并从标注曲线上查出相应的白蛋白 浓度。,3.白蛋白/球蛋白比值（A/G比值） 用双缩脲法测定血清标本中的总蛋白浓度，用
7、总蛋白浓度减去白蛋白浓度 即得球蛋白浓度，并可求的A/G比值：,A/G比值=,白蛋白含量,总蛋白含量-白蛋白含量,【注意事项】 5BCG是一种PH指示剂，变色域为PH3.8（显黄色）5.4（显蓝绿色），因此控制反应液的PH是本法测定的关键。 6蛋白质标准液是一个复杂的问题，实验证明，BCG不但与白蛋白呈色，而且与血清中多种蛋白质成分呈色，其中以球蛋白、运铁蛋白、结合珠蛋白更为显著，其反应速度较白蛋白稍慢。由于30S内呈色对白蛋白特异，故BCG与血清混合后，在30S内读取吸光度，可明显减少非特异性呈色反应。为了减少本法基质效应的影响，最好用参考血清作标准。,血清总蛋白TP的正常值为60-80g/
8、L，白蛋白A 正常值40-55g/L,球蛋白G的正常值为20-30g/L。 白蛋白在血清中含量最高，分子量小，是维持血浆渗透压的75%-80%，是维持血浆渗透压的主要物质，白蛋白低于20g/L，会出现水肿和腹水。,临床意义,1.清总蛋白生理性波动：长久卧床者比直立活动者约低35g/L；新生儿比成人低58g/L；60岁以上的老人约比青壮年低2g/L。 2.清总蛋白增高： 血液浓缩：腹泻、呕吐等。 合成增加：如多发性骨髓瘤等。 3.清总蛋白降低： 血液稀释：过多注射低渗溶液，各种原因引起的水钠潴留。 摄入量不足和消耗增加：营养不良、慢性肠胃炎、严重结核病等。 合成障碍：肝脏疾病。 蛋白质丢失：严重烧伤时大量血浆渗出，肾综合症等。,【临床意义】 1血清白蛋白浓度增高，常见于严生脱水所致的血浆浓缩 2血清白蛋白浓度降低 在临床上比较重要和常见，通常与总蛋白降低的原因大致相同。急性降低主要见于大出血和严重的烧伤；慢性降低见于肾病蛋白尿，肝功能损伤，肠道肿瘤及结核病伴慢性出血，营养不良和恶性肿瘤等。血清白蛋白低于20g/L。临床上出现水肿。 3A/G 某些病人可同时出现白蛋白减少和球蛋白升高的现象，严重者比值可1。这种情况称为A/G比值倒置。 4文献报道还有极少见的因白蛋白合成障碍，血清中几乎没有白蛋白的先天性白蛋白缺乏症。,
