1、第六章 酶,第一节 引论,一、酶对食品科学的重要性 控制着所有重要的生物大分子的合成、分解 食品加工的主要原料是生物材料, 生物材料中含有大量的酶 酶的作用 有益的：皱胃酶、蛋白酶 有害的：果胶酶、脂酶 有效地使用和控制内源酶和外源酶,二、酶的本质,定义（1979年） 酶是具有催化性质的蛋白质，其催化性质源自于它特有的激活能力。目前 并非都是蛋白质,酶是生物催化剂,不参与反应，反应结束时保持不变 酶在物理和化学状态上的改变是可逆的 酶反应中包含可逆的中间络合物 酶被反复使用 酶的周转率（Turnover） 在酶被完全饱和条件下，单位时间内底物被每个酶分子转变成产物的分子数。 大多数酶，1104
2、 s-1 少量的酶（昂贵）大量的生物转化,酶具有特异性（Specificity）,酶作为催化剂的机制 Emil Fischer提出的“锁和钥匙”模式特殊形状的活性部位精确地立体互补 高度专一,锁,钥匙,Koshland的“诱导楔合” 模型,要点 底物诱导酶蛋白几何形状的改变 催化基团能精确地定向和底物结合到酶的活性部位上去,A、B：催化基团 C：结合基团,三、酶的命名,习惯命名 -淀粉酶、纤维素酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、过氧化物酶或过氧化氢酶 商品名称 系统命名 4位数字组成的酶委员会编号（EC number）,酶的系统命名的原则,例：聚半乳糖醛酸酶，EC 3.2.1.15,水解酶，糖苷键，
3、O-糖苷,四、酶的辅助因子,酶在作用时需要有一个非蛋白质组分存在，这个组分称为辅助因子 分类 金属离子 羧肽酶-Zn，激酶-Mg 有机化合物B族维生素 辅酶（coenzyme）,五、在生物体中的酶,酶在原料的生长和成熟中起重要的作用 原料收获后酶仍然起作用 直至酶的底物被耗尽或酶变性 由于细胞结构的解体常使酶活力提高 果胶酶使番茄组织软化 多酚氧化酶使果蔬褐变,（一）酶的分布,不均匀的，定位化，区域化分布 一种酶往往仅存在于细胞的一类细胞器，专门执行有限种类的酶催化反应细胞核：核酸的生物合成和水解降解线粒体： 与ATP有关的氧化还原酶溶菌体和胰酶原颗粒 ：水解酶 特定的器官含有特定种类的酶 胃
4、肠道、口腔、小肠 植物的种子：水解酶,（二）酶的隔离分布和与底物的接近,在完整的细胞内，酶通过各种方式和底物隔离 细胞器、细胞膜、细胞壁、内源酶抑制剂 组织解体使酶与底物接近 会导致食品的色泽、质构、风味、芳香和营养质量上的改变 热处理、低温保藏和酶抑制剂的使用有助于稳定产品质量,（三）酶在食品原料中的含量,不同食品原料所含酶的种类和数量不同 同一种酶在同一种食品原料中的含量还取决于 生物体的年龄（成熟度） 生长的环境条件 温度、水的供给、土壤、肥料,六、酶的纯化和测定,不是纯酶，含有杂酶和非酶组分 酶的分离纯化技术包括： 选择性沉淀 高浓度盐或有机溶剂 膜分离技术 柱层析技术 凝胶过滤色谱分
5、子大小 离子交换色谱电荷密度 亲和色谱特定基团的亲和力,选择生产酶制剂的微生物 产生的酶纯度高，价格低廉 常使用霉菌和细菌酶制剂 酶回收再利用，降低成本 酶的固定化技术,酶活的测定,测定酶活力的方法 通过定量测定酶反应的产物或底物的变化进行测定 通过定量测定酶反应底物中某一性质的变化，如粘度来测定 酶活定义 在一定条件下，催化单位底物转变成产物所需的酶量。,酶活单位,U:国际生物化学协会酶委员会定义:每分钟催化1 mol底物发生转变的酶量即：1 mol/min。 kat： 酶活力的SI单位，即Katal。 Katal的定义是每秒钟催化1mol底物发生转变的酶量，即：1mol/s 。 换算关系1
6、 kat = 6107 U 1 U = 1.66710-8 kat=16.67 nkat,第二节 影响酶活力的因素,内在因素 酶的浓度 底物的浓度 环境条件 pH 温度 水分活度 抑制剂,一、底物浓度,反应速度V和底物浓度S的关系非线性,酶“饱和”,酶反应,E+S ES E+PE 游离状态酶 S 底物 ES 酶-底物络合物 P 反应产物 k 反应速度常数,k1,k-1,k2,Km ：Michaelis 常数，米氏常数 Vmax：最大反应速度，所有的酶都以ES形式存在，及酶被底物饱和,截距=1/vmax 斜率=Km/ vmax,1/v,vmax的意义 在最适条件和被底物饱和时的理论上的最高酶活力
7、 Km的意义 v=vmax/2时，Km=S 当酶反应速度达到最高反应速度一半时的底物浓度,Km指示酶与底物的亲和力较低Km，亲和力高，催化效率高,二、酶浓度,当ES， 反应速度酶浓度,长时间范围内 初速度保持不变，然后下降 初速度保持的时间与酶的种类有关 酶活下降的原因 产物的抑制作用 酶失活,反应动力学,反应早期 S是一个常数 酶反应是零级反应 反应进行 S下降 反应遵循一级动力学,反应速度常数,三、pH,S形或钟形,pH影响酶活力的原因,pH影响酶分子上电荷的分布 取决于酶蛋白质的氨基酸侧链上可离解基团的状态 可离解基团可能处于酶的活性部位，因此影响酶与底物的结合和催化作用,V-pH曲线确
8、定最适pH,采用酶反应的初速度 酶的pH 稳定范围 测定方法 相同的温度、缓冲液、酶浓度 不同的pH下保温,极端的pH一般会使酶失活 大多数酶的最适pH在4.5-8.0 特殊情况 胃蛋白酶-1.8 精氨酸酶-10.0,四、温度,（一）酶的热稳定性测定方法：酶液置于不同温度下保温一定时间后测定酶活,酶失活动力学,遵循一级动力学 ln u-lnu0=kt Arrnenius方程 Ea：酶热变性的活化能 R：通用气体常数 ln残余百分酶活时间 呈线性关系 直线的斜率为,（二）酶催化反应的活化能,高活化能表示反应速度随温度的提高很快提高 酶降低活化能，产生两个效果 低温下，使高比例的反应物转变成产物
9、升高温度对酶反应速度造成的影响相对较小 在酶稳定的范围内，尽可能采用高温,（三）低温下酶的活力,加热使有损质量的内源酶失活 食品原料部分冻结（0以下）时，酶的活动并没有完全停止 低温使酶活力下降,但应避免稍低于冰点的温度保藏食品 水冻结后，酶和底物浓缩，促进酶活 冻结和解冻破坏组织结构，酶容易接近底物,五、水分活度,食品原料中的水分含量必须低于1%2%，才能抑制酶活力,有机溶剂（甘油）和水混合水分体积分数减少，酶活力下降,有机溶剂对酶反应的影响,影响酶的稳定性和反应进行的方向 有机溶剂与水不互溶 反应移向催化合成反应 有机溶剂与水互溶 反应移向催化水解反应,六、酶抑制动力学,G的绝对值很小，逆
10、向反应不能忽视 产物的积累产生抑制作用 其它物质也会产生抑制作用 对酶的抑制可以是不可逆的 但可逆抑制更常见,动力学方程式,（一）竞争性抑制,ES不和抑制剂结合，EI不和底物结合 竞争性抑制剂的结构和底物相似，这两种分子与酶结合的部位相同 S+E 与 I+E竞争 vmax没有影响，Km 底物S足够高，可以消除竞争性抑制,（二）非竞争性抑制,S+E 不影响 E+I Km没有影响，vmax I同时和S、E反应 增加S不能消除,（三）反竞争性抑制,I不与E反应 Km 、vmax都同步减小 很少见,七、其他环境条件,（一）粘度 90%以上的自由水被冻结 未冻结相的粘度会显著提高 酶和底物分子的移动性降
11、低 酶活力下降,（二）压力,一般压力不致于高到使酶失活 几种处理方式相结合时，导致酶失活 压力-高温处理 压力-高剪切处理 高压灭酶,（三）剪切,混合、管道输送、挤压，使酶失活 在作用停止后，酶活再生,（四）超声能量,使酶失活 空化作用（起泡）导致酶的界面变性 酶失活过程不符合一级动力学,（五）离子辐射,离子辐射能使酶完全失活所需的剂量比破坏微生物所需的剂量大10倍。 缺氧和干燥条件下，酶稳定性高 室温下比低温下失活的程度高 采用热-离子辐射结合处理的方法,（六）溶剂,与水不互溶的溶剂稳定酶 互溶的溶剂能使酶失活 温度低时，较稳定,第三节 固定化酶,酶被固定成为不溶解的状态 优点 酶的稳定性提
12、高 酶能反复多次使用 产物中不含酶，不需要采用热处理灭酶，有助于提高食品的质量,一、酶的固定方法,（一）吸附 将酶吸附在氧化铝、有机聚合物、玻璃、无机盐或硅胶等材料上优点： 无需特殊化学试剂，简便价廉 缺点： 结合力是弱键作用，当温度、pH和离子强度改变，或者当底物存在时，结合的酶可能会解吸。,（二）共价连接 化学试剂或双官能试剂（如戊二醛） 载体 优点： 共价键牢固，酶不易泄漏 缺点： 一部分酶起着载体的作用而失去了催化能力，因此用交联法固定的酶活力较低。对于价格昂贵的酶，不经济。,（三）载体截留 凝胶（聚丙烯酰胺） 特点： 低MW底物可通过扩散自由进入凝胶颗粒，酶和高MW的终产物不能从凝胶
13、颗粒中渗漏出去。 局限： 只能适用于低MW底物。食品体系常常有大分子。酶通过扩散而损失的可能性还是存在的。,（四）胶囊包合 类似载体截留法，形成很小的颗粒或胶囊 硝酸纤维素或尼龙 只适合低MW底物,二、固定化酶动力学,酶被固定，仅底物能自由扩散 酶的载体被扩散层包围 邻近酶的底物浓度低于体相中底物浓度 静电作用 反应初速度v0不再适用,表观米氏常数,扩散项,静电项,X、D：扩散系数 较小的载体或提高流动速度可使X，Km* ,Z、v：与电性质有关 底物和载体电荷相同，Km*,酶-底物亲和力,三、固定化酶在食品工业中的应用,仅有少数固定化酶被应用于工业化 固定化葡萄糖异构酶，生产高果糖浆玉米淀粉
14、糊精（DP10）葡萄糖 高果糖浆,-淀粉酶,葡萄糖淀粉酶,葡萄糖异构酶,菌种 链霉素、凝结芽孢杆菌、放线菌 载体 DEAE-纤维素、多孔陶瓷 反应平衡常数=1，葡萄糖=果糖,其它固定化酶 氨基酰基转移酶 天冬酶 富马酸酶 半乳糖苷酶：水解棉子糖（防止蔗糖结晶） 乳糖酶：水解乳糖（乳糖不耐症） 应用于食品分析酶电极,第四节 内源酶对品质的影响,酶对生物体的重要性 酶催化反应产生的效果 加快食品变质的速度 提高食品的质量 控制酶活力,一、颜色,颜色食品质量 以瘦肉为例 氧合肌红蛋白红色 脱氧肌红蛋白紫色 高铁血红蛋白(Fe2+氧化为Fe3+ )褐色,导致色素变色的三种酶,1. 脂肪氧合酶六方面的功
15、能 小麦粉和大豆粉的漂白 面团制作中形成二硫键 破坏叶绿素和胡萝卜素 产生氧化性的不良风味 氧化破坏维生素和蛋白质 氧化破坏必需脂肪酸,有益,有害,脂肪氧合酶催化过程,作用于不饱和脂肪酸产生自由基中间物 产生氢过氧化物 进一步非酶反应，产生醛等不良风味 最敏感的氨基酸是半胱氨酸、酪氨酸、组氨酸和色氨酸,2. 叶绿素酶,水解叶绿素产生植醇和脱植基叶绿素 果蔬失去Mg2+，失去绿色,3. 多酚氧化酶,存在于植物、动物和一些微生物中 催化两类反应,羟基化,氧化,黑色素褐变,非酶反应,控制多酚氧化酶的活力,消除氧和酚类化合物 抗坏血酸、亚硫酸盐和巯基化合物 有还原性，将邻-苯醌还原成底物，防止黑色素
16、直接使酶失活 破坏活性中心的组氨酸残基和Cu2+ 非底物的酚类（苯二酚、苯甲酸） 酶抑制剂（与底物竞争酶）,二、质构,果蔬 果蔬的质构取决于碳水化合物 果胶物质、纤维素、半纤维素、淀粉、木质素 自然界存在作用于碳水化合物的酶 动物组织和高蛋白质植物组织 蛋白酶作用导致质构的软化,（一）果胶酶,1. 果胶甲酯酶 水解甲酯键，生成果胶酸和甲醇二价离子Ca2+存在时，与羧基交联，提高质构强度,2. 聚半乳糖醛酸酶,水解-1,4 糖苷键包括两种 内切：从果胶分子内部水解糖苷键 端切：水解分子末端的糖苷键,3. 果胶酸裂解酶,存在于微生物中，非高等植物中 裂解果胶和果胶酸分子中的糖苷键形成一个含还原基团
17、的产物和一个双键产物 235 nm 处有特征吸收,（二）纤维素酶,果蔬中的纤维素影响细胞的结构 纤维素酶与食品原料的软化有关 微生物纤维素酶将不溶性纤维素转化为葡萄糖,（三）戊聚糖酶,存在与微生物和一些高等植物中 水解木聚糖、阿拉伯聚糖和阿拉伯木聚糖（5碳聚糖） 小麦中存在 微生物戊聚糖酶制剂,（四）淀粉酶,存在于动物、高等植物和微生物中 淀粉决定食品的粘度和质构 淀粉降解,淀粉酶的类型, -淀粉酶 存在于所有的生物 内切酶，水解“干” 显著影响粘度 高温下才失活 -淀粉酶 存在于高等植物中 端解酶，水解“支” 被巯基试剂（半胱氨酸）所抑制 葡萄糖淀粉酶,（五）蛋白酶,蛋白质决定动物性食品原料
18、的质构 1组织蛋白酶（Cathepsins） 存在于动物组织细胞的溶菌体内 五种组织蛋白酶：A、B、C、D和E，还分离出一种组织羧肽酶 参与了肉成熟期间的变化 宰后pH下降，酶释放，导致肌原纤维以及胞外结缔组织（胶原）分解 在酸性pH具有活性。在pH 2.54.5范围内具有最高的活力。,2钙离子激活中性蛋白酶,两种：CANP和CANP 都是二聚体 含有相同的较小亚基（MW=30,000）和较大的亚基（MW=80,000，免疫性质不同）。 活性部位中含有半胱氨酸残基的巯基，被归属于半胱氨酸（巯基）蛋白酶,CANPS的作用,CANP I 完全激活：50-100 mol/L Ca2+ CANP II
19、 的激活：1-2 mmol/L Ca2+ 肌肉中的活力是很低的 通过分裂特定的肌原纤维蛋白质影响肉的嫩化 同溶菌体蛋白酶协同作用 死后僵直的肌肉缓慢松弛，这样产生的肉具有良好的质构,3乳蛋白酶,碱性丝氨酸蛋白酶 水解-酪蛋白产生疏水性更强的-酪蛋白，也能水解s-酪蛋白，但不能水解-酪蛋白 奶酪成熟过程中参与蛋白质的水解作用 对热较稳定，形成乳的凝胶 还存在着一种最适pH 4左右的酸性蛋白酶，易热失活,三、风味,1硫代葡萄糖苷酶在芥菜子和辣根中存在着芥子苷S-糖苷发生糖苷配基裂解和分子重排产物中异硫氰酸酯是含硫的挥发性化合物，与葱的风味有关 芥子油即为异硫氰酸烯丙酯,裂解和分子重排,芥子油 具有
20、特殊风味,S-糖苷的酶分解,2. 过氧化物酶,普遍地存在于植物和动物组织中 过氧化物酶活力会损害食品的质量，未经热烫的冷冻蔬菜所具有的不良风味与酶的活力有关 各种不同来源的过氧化物酶通常含有一个血色素（铁卟琳）作为辅基。,过氧化物酶催化下列反应： ROOH+AH2 H2O+ROH+A ROOH：有机过氧化物 AH2被氧化，是电子给予体 抗坏血酸、酚，胺或其他有机化合物 被氧化成有色化合物 分光光度法测定过氧化物酶的活力,电子给予体,过氧化物酶的热稳定性,热失活具有双相特征 每一相都遵循一级动力学 热失活曲线的3部分 热不稳定部分 过渡区域 热稳定部分,过氧化物酶的再生 非常耐热，作为果蔬热处理
21、是否充分的指标 其它作用 作为过氧化氢的去除剂 参与木质素的生物合成 参与乙烯的生物合成 作为成熟的促进剂，与果蔬的成熟有关,四、营养质量,脂肪氧合酶 必需脂肪酸含量的下降 氧化过程中产生的自由基，降低维生素和氨基酸含量 抗坏血酸氧化酶 硫胺素酶破坏硫胺素（氨基酸代谢中必需的辅助因子） 核黄素水解酶 多酚氧化酶引起褐变的同时，降低有效赖氨酸的含量,第五节 作为食品加工的助剂 和配料而使用的酶,使用酶的目的 回收副产物 制造食品 提高提取的速度及产量 改进风味和稳定食品质量,使用酶的优点,天然、无毒 催化的特异性，不造成不需要的副反应 一般是粗酶制剂，可能会产生不期望的产物；但使用高纯度的酶制剂
22、在经济上不合算 在很温和的温度和pH条件下具有活性 低浓度时有活性 易于控制反应速度 在反应进行到期望的程度后即可使酶失活,酶的来源,可食的和无毒的植物、动物以及非致病、非产毒的微生物 微生物来源酶的优点 生产能力强 诱变或改性 胞外酶，易于回收 生产原料易于获得,一、甜味剂中使用的酶,酶法生产甜味剂,二、脂酶,水解处在油/水界面的三酰基甘油的酯键 广泛地分布于植物、动物和微生物 动物胰脏脂酶和微生物脂酶是脂酶的主要来源 水解方式1,2-二酰基甘油 三酰基甘油 一酰基甘油2,3-二酰基甘油,脂酶的专一性,酰基甘油专一性 优先水解低MW的三酰基甘油底物 位置专一性 如胰脂酶，仅水解1,3位置的酯
23、键能水解1位和2位酯键的脂酶可能是混合酶 脂肪酸专一性 水解特定脂肪酸形成的酯键 微生物白地霉脂酶油酸，优先水解 立体定向专一性,脂酶的应用,奶酪加工中 从乳脂中释出风味前体和风味化合物 三酰基甘油改性 通过脂酶催化的酯交换反应，生产新的甘油三酯，后者具有期望的熔点或其他性质 在非水环境下有可能实现，如果有水存在，脂酶将快速水解甘油三酯 技术关键：固定化脂酶制剂,油脂水解 技术上可行，能否应用于实际生产取决于它和其他技术，例如蒸汽裂解的竞争 从天然的甘油三酯制备多不饱和脂肪酸时，会优先考虑酶法 合成乳化剂和风味剂 安全、天然,三、蛋白酶,蛋白酶的来源 内源蛋白酶 肉类成熟 酵母自溶制备酵母提取
24、物 微生物分泌的蛋白酶 加入的蛋白酶制剂 蛋白质强化饮料,蛋白酶的作用,改进食品蛋自质的性质 MW分布发生变化 水解度，MW小的肽的比例 水解蛋白质的溶解度 乳化能力和起泡能力改变 控制蛋白质的水解程度是至关重要的,蛋白质的酶水解过程,肽键水解后，羧基和 -氨基间产生质子交换 在pH 6.5以上时，质子化的氨基酸将离解 要保持反应体系pH不变，就必须加入碱液,采用pH-stat法控制水解度（DH）适用于中性或碱性蛋白酶B 碱消耗的当量数 -氨基的平均离解常数h总 可被水解的肽键数，8,蛋白酶的分类,按活性中心所含有的必需的催化基团分类 丝氨酸蛋白酶-羟基 胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶和凝
25、血酶以及微生物蛋白酶 巯基蛋白酶（或半胱氨酸蛋白酶）-巯基 木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶以及微生物蛋白酶（链球菌蛋白酶） 金属蛋白酶-Zn2+ 肽链端解酶，例如羧肽酶A 天冬氨酸蛋白酶（或酸性蛋白酶）-羧基 最适pH范围是2-4,蛋白酶的应用,制备水解蛋白质 （如生产大豆水解蛋白） 从油料种子加工分离蛋白质 制备浓缩鱼蛋白质 改进明胶生产工艺 凝乳酶和其他蛋白酶应用于干酪生产 从加工肉制品的下脚料回收蛋白质 对猪（牛）血蛋白质进行酶法改性脱色 作为食品添加剂改善食品的质量 木瓜蛋白酶用于配制肉类嫩化剂 减少 啤酒低温混浊现象,四、果胶酶,1提高果汁得率 果实破碎后加入果胶酶，降低粘度，
26、再压榨或离心 2果汁澄清 直接压榨后，用果胶酶处理，使果汁混浊的粒子沉淀下来 混浊粒子是蛋白质-碳水化合物复合物，粒子表面带负电荷，在果胶等构成的保护层里面则是带正电的蛋白质 苹果汁澄清包括酶催化果胶解聚和非酶静电相互作用两个阶段。,五、纤维素酶,使纤维素增溶和糖化 分为4类 内切葡聚糖酶 粘度快速下降，还原基团缓慢增加 纤维二糖水解酶 端解酶，还原基团较快增加 端解葡萄糖水解酶 水解速度随底物链长的减小而降低 -葡萄糖苷酶 水解速度随底物链长的减小而增加,第六节 酶在食品分析中的应用,优点 酶具有高度灵敏度和专一性，无需将待测物与试样中其他组分分离 步骤简单，节省时间 可以将非酶造成的化合物
27、的变化降至最低 缺点 试剂昂贵，尤其是纯酶,一、被测定的化合物是酶的底物,1标准曲线法 适用条件 待测物的浓度必须小于100Km（最好小于5Km） 计算方法 根据米氏方程 关键 严格控制酶反应的条件，制作关系良好的标准曲线,2总变化法 适用条件 反应必须进行完全 方法 从反应前后酶反应体系的吸光度或荧光的总变化测定产物（或底物）的量 优点 不需要精确控制酶反应条件 缺点 需要使用较多的酶,二、待测物是酶的激活剂或抑制剂 激活剂反应初速度增加时，可根据增加的程度测定该化合物的浓度。三、固定化酶在食品分析中的应用 重复使用，降低每次分析的费用 使分析工作更加快速和简易 使用形式 固定化酶柱、酶电极、含酶薄片和结合酶的免疫吸附剂（ELISA）,四、酶作为食品质量的指示剂,指示热处理是否充分 检测食品原料是否经受冷冻和解冻 检测食品受细菌等污染的程度 指示水果的成熟度 可能出现过分褐变的指示剂 洋葱和大蒜风味 体外酶法评价高蛋白食品的营养质量,
