1、细胞培养基本技术 实验概要无菌操作基本技术 1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射 30-60 分钟灭菌，以 70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转 10 分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以 70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转 10 分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。 2. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品
2、用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以 70 % ethanol 擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。 3. 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约 45 角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。 4. 工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少 Class II)。操作过程中，应避免引起 aerosol 之产生，小心毒性药品，例如 DMSO 及
3、 TPA 等，并避免尖锐针头之伤害等。 5. 定期检测下列项目： a: CO2 钢瓶之 CO2 压力 b: CO2 培养箱之 CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染 (水盘的水用无菌水，每周更换)。c: 无菌操作台内之 airflow 压力，定期更换紫外线灯管及 HEPA 过滤膜，预滤网(300小时/预滤网，3000 小时/HEPA)。 6. 水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750)，定期更换水槽的水。实验原理主要试剂培养基 1. 液体培养基贮存于 4 oC 冰箱，避免光照，实验进行前放在 37 oC 水槽中温热。 2. 液体培养基(加血清) 存放期为六个月，期间 glutamine 可能
4、会分解，若细胞生长不佳，可以再添加适量 glutamine。 3. 粉末培养基配制(以 1 升为例)： 细胞培养基通常须添加 10 % 血清，因此粉末培养基之配制体积为 900 ml，pH 为 7.2 - 7.4。NaHCO3 为另外添加，若将 NaHCO3 粉末直接加入液体培养基中会造成 pH 之误差，或局部过碱。因此粉末培养基及 NaHCO3 粉末应分别溶解后才混合，然后用 CO2 气体调整 pH，而非用强酸(HCl) 或强碱(NaOH) ，因为氯离子对细胞生长可能有影响，且贮存时培养基的 pH 易发生改变。 材料： a: 纯水 (milli-Q 水或二次至三次蒸馏水，水品质非常重要 )
5、b: 粉末培养基 c: NaHCO3 (Sigma S-4019) d: 电磁搅拌器 e: 无菌血清瓶 f: 0.1 或 0.2 mm 无菌过滤膜 g: pH meter h: 真空帮浦 i: CO2 气体 步骤： a: 取粉末培养基溶于 700 ml milli-Q 水中，搅拌使其溶解。 b: 称取适量之 NaHCO3 粉末(数量依培养基种类而异)溶于 200mlmilli-Q 水中，搅拌使其溶解，然后通入 CO2 气体至饱和，约 3-5 分钟。 c: 将溶解且含饱和 CO2 之 NaHCO3 溶液加入溶解之液体培养基中混合。混后溶液之 pH 应为 7.2-7.4，除非 pH 值偏差太大，否
6、则不需用酸碱再调整之。若为太碱，可再通入 CO2 气体调整 pH。培养基以真空帮浦通过过滤膜时， pH 会升高 0.1-0.2。 3.3.4. 以 0.1 或 0.2 mm 无菌过滤膜过滤灭菌，同时分装至无菌容器中，标示培养基种类、日期、瓶号等，贮存于 4 oC。(血清亦可加入培养基中一起过滤) d: 配制之培养基配制须作生长试验与污染测试。 4. 配制培养基之生长测试 材料： a: MDCK cell (ATCC CCL-34 或 CCRC 60004) b: 6-well TC plate (or 35 mm TC dish) c: methanol d: glacial acetic a
7、cid e: 10 % Giemsa solution (GibcoBRL 10092-013)主要设备实验材料实验步骤1.材料： 1.1. 细胞培养实验用品均为无菌，除了玻璃容器与 pasteur pipet 外，其它均为塑料无菌制品。 1.2. TC 级培养盘表面均有 coating 高分子物质以让细胞吸附，培养容器种类有Tflask, plates, dishes, roller bottle 等，依实验需要使用。 1.3. plastic sterile pipet: 1 ml, 2 ml,5 ml, 10 ml, 25 ml 1.4. 塑料离心管: 15 ml, 50 ml，均有 2
8、 种不同材质，其中 polypropylene (PP) 为不透明材质，polystyrene (PS) 为透明材质，可依实验需要而选择适合材质之离心管。 1.5. glass pastuer pipet: 9 inch，用以抽掉废弃培养液等。 1.6. 玻璃血清瓶(Pyrex or Duran glassware)：100 ml, 250 ml,500 ml,1000 ml 2. 清洗： 2.1. 新购玻璃血清瓶先以 0.10.05 N HCl 浸泡数小时，洗净后才开始使用。 2.2. 用过之玻璃血清瓶，以高压蒸汽灭菌，洗净后分别用一次与二次去离子水冲洗干净，勿加清洁剂清洗。 3. 灭菌：
9、3.1. 实验用玻璃血清瓶以铝箔纸包覆瓶盖，高压蒸汽灭菌 121 oC, 15 lb, 20 分钟，置于 oven 中烘干。 3.2. 实验用玻璃 pasteur pipet 以干热灭菌 170 oC, 4 小时。 3.3. 液体或是固体废弃物可用 10 % hypochloride 溶液(次*，即漂白水) 或是蒸汽高压灭菌 121 oC, 15 lb, 20 分钟处理。 4. 步骤：4.1. 以待测试培养基培养 MDCK cell，接种 MDCK 细胞于 6-well plate (或35mm TC dish) 中，每个 well 接种 1102 活细胞，同时作对照组实验。 4.2. 接种
10、57 天后，在 100 倍倒立显微镜作观察细胞群落之生长，待细胞群落大到可以肉眼观察，而群落间不互相接触时即可。 4.3. 去除培养基，加入 1 ml Carnoys 固定液(甲醇：冰醋酸 3:1)，室温下静置 10 min。 4.4. 去除固定液，水洗二次。 4.5. 加入 1 ml 10 % Giemsa solution， ，室温下静置染色 2-3 min。 4.6. 去除染液，水洗二次。 4.7. 以肉眼计数群落数，并比较之，若新配制或新批号的培养基对细胞生长不佳，则丢弃之。5. 抗生素： 5.1 细胞库之细胞培养基不加抗生素 5.2 培养自 ATCC 引进之细胞株，培养基中不加抗生素
11、。 5.3 培养自其它实验室引进之细胞株，制作 token freeze 前培养基须添加抗生素，待 token freeze 通过污染测试后，大量培养时则不加抗生素。 5.4 寄送活细胞时，须将培养液充满整个 flask 时，则须添加抗生素(penicillin 100 units/ml streptomycin 100 ug/ml)。 5.5 若要检测 mycoplasma，则培养基内不可添加 gentamicin，因 gentamicin 会抑制 mycoplasma 生长。 5.6 去除细菌污染之抗生素混合配方: penicillin 250 units/ml, streptomycin
12、 250 ug/ml, neomycin 250 ug/ml, bacitracin 2.5 units/ml，注意混合使用后药物毒性会增强。 5.7 抗生素使用种类与浓度： 工作浓度. 储存温度. 杀灭细菌 penicillin 100 units/ml -20 G( ) bacteria streptomycin 100 ug/ml -20 G( ) and G(-) bacteria chlotetracycline 50 ug/ml -20 G( ) and G(-) bacteria gentamicin 50 ug/ml -20 G( ) and G(-) bacteria, my
13、coplasma amphotericin B 2.5 ug/ml -20 yeast and molds nystatin 50 ug/ml -20 yeast and molds fungizone 2.5ug/ml -20 yeast and molds6. 血清： 6.1 血清必须贮存于20 -70 ，若存放于 4 ，请勿超过一个月。如果一次无法用完一瓶，可将 4045 ml 分装于无菌 50 ml 离心管中，由于血清结冻时体积会增加约 10 %，必须预留此膨胀体积之空间，否则易发生污染或容器冻裂之情形。 6.2 一般厂商提供之血清为无菌，不需再无菌过滤。若发现血清有许多悬浮物，则可将
14、血清加入培养基内一起过滤，勿直接过滤血清。 6.3 瓶装(500ml) 血清解冻步骤(逐步解冻法): -20 或70 至 4 冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装，一般以 50 ml 无菌离心管可分装 4045 ml。在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡 )，使温度与成分均一，减少沈淀的发生。勿直接由20 直接至 37 解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沈淀。 6.4 heat-inactivation 是指 56 , 30 分钟加热已完全解冻之血清。加热过程中须规则摇晃均匀。此热处理之目的是使血清中之补体成份(complement) 去活化。除非必须，一般不建议作此热处理，因
15、为会造成沈淀物之显著增多，且会影响血清之品质。6.5 勿将血清置于 37 太久，若在 37 放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定之成份亦会因此受到破坏，而影响血清之品质。 6.6 血清之沈淀物 6.6.1 凝絮物：发生之原因有许多种，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein) 变性及解冻后血清中存在之血纤维蛋白(fibrin) 造成，这些凝絮沈淀物不会影响血清本身之品质。若欲减少这些凝絮沈淀物，可用离心 3000 rpm, 5 min 去除，或离心后上清液可以加入培养基中一起过滤。不建议用过滤步骤去除这些凝絮沈淀物，因为会阻塞过滤膜。 6.6.2 显微镜下观察之“小黑点”：通常经过热处理之血清，沈淀物的形成会显著的增多。有些沈淀物在显微镜下观察像是“小黑点” ，常会误认为血清遭受污染，而将血清放在 37 中欲培养此“ 微生物“，但在 37 环境下，又会使此沈淀物增多，更会误认为微生物之增殖，但以培养细菌之培养基检测，又没有污染。一般而言，此小黑点应不会影响细胞之生长，但若怀疑此血清之品质，应立即停用，更换另一批号的血清。
