1、细 胞 培 养 池文杰,一、细胞培养的基本知识,(一)培养细胞的特性 1.培养细胞的生长方式 贴附生长： 必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞。悬浮生长：于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞。,2. 培养细胞的生长特点：a.贴附贴附并伸展，是多数体外培养细胞的基本生长特点。虽然血细胞如淋巴细胞在活体体内并无聚集的倾向并在体外可于悬浮状态中生长，但是大多数的哺乳动物细胞在体内和体外均附着于一定的底物而生长。b.接触抑制及密度依赖性,3. 细胞培养的生长过程,(1) 细胞系的生长过程(三个阶段)： a.原代培养或初代培养期取自体内新鲜组织并置于体外条件
2、下生长的细胞在传代之前称为原代培养(14周) b.传代期细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种至两个或者更多的培养器皿中(数天到一周左右) c.衰退期在此期间细胞开始时虽仍然存活，但生殖已经很缓慢并逐渐完全停止，进而细胞发生衰亡、死亡(传代3050次以后),(2) 每代细胞的生长过程 a.滞留期：包括游离期及潜伏期游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮态，也称为悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。10min4h潜伏期：此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为624h。 b.指数生长期：又称对数期。此期间细胞增殖旺盛，成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。细胞生长增殖状况可以依据
3、细胞倍增情况(细胞群体倍增时间)及细胞分裂指数等来判断。(35天),c.生长停止期(平台期)：此期可供细胞生长的底物面积已被生长的细胞所占满，细胞虽尚有活力但已不再分裂增殖。此时细胞虽已停止生长，但仍存在代谢活动并可继续存活一定的时间。,(二) 培养细胞生长的条件,1 细胞的营养需要a.基本营养物质：氨基酸、维生素、碳水化合物及一些无机离子b.促生长因子等物质c.此外激素也可有助于细胞生长 2 细胞的生存环境a.温度: 适宜的温度与取材的动物种类有关b.气相及pH:一般气体环境为95%空气加CO2的混合气体。 pH: 7.2-7.4 。CO2为细胞生长所需要，同时又是细胞代谢的产物，并与维持培
4、养基的pH有关， CO2增加将使pH下降。CO2 +H2O H2CO3 H+ + HCO3-,3 渗透压：因细胞的类型及种族而异。由于人类血浆的渗透压约为290m mol/L，因此认为这是体外培养人类细胞的理想渗透压。 4 无污染及无毒：无毒是培养细胞的必须条件。凡与细胞直接接触者(如培养瓶、底物、培养剂等)或间接接触者(如瓶盖瓶塞等)，若具细胞毒性，都会导致细胞的死亡。污染问题包括细菌等微生物的污染、不同细胞类型的交叉污染及上述有害物质的污染。,二、细胞培养室的设备和准备工作,1 设备： 超净工作台，CO2培养箱，倒置显微镜 干燥箱，自动双重纯水蒸馏器，纯水仪，压力蒸汽消毒器，滤器 离心机及
5、天平 冰箱，细胞冷冻存储器(液氮容器或低温冰箱) 常用培养器皿：培养瓶，培养皿，多孔培养板，吸管，加样器 其它用品：离心管，冻存管，酸缸，烧杯，注射器，量筒等,NEXT,超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。,使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题： 用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。 保持培养箱内空气干净。定期消毒。 箱内火菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。,玻璃：浸泡刷洗(洗洁精)烘干酸泡(24h )流 水、单蒸双蒸分别冲洗烘干 塑料： a.滤器和
6、注射器：清水、单双蒸各超15min烘干 b.多孔培养板： c.胶塞，瓶盖等：流水、单蒸双蒸分别冲洗烘干用双蒸水煮沸30min 烘干 消毒灭菌：高温湿热灭菌玻璃：121 ，30min塑料：115 ，15min(多孔板用紫外照射),2 培养用品的清洗消毒灭菌,NEXT,洗液的配制,1 培养用液 a.水：蒸馏水或去离子水 b.平衡盐溶液(BSS)：维持渗透压、调节pH值以及供给细胞生存所需的能量和无机离子成分。主要作为合成培养基的基础液及用于洗涤组织、细胞等。一般用PBS缓冲液 c.消化液：0.25%胰蛋白酶液，其功能主要使细胞间的蛋白质水解，细胞分散。,三、细胞培养用液和培养基,2 培养基定义：维
7、持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。合成培养基:根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前有RPMI-1640、 DMEM、 TC199、MEM等。 主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。 优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低 缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。,培养基的配制,RPMI-1640 1袋(10.4g)碳酸氢钠 2.0 g青、链霉素 各100U/mL加去离子水至 1000mL，调节pH值至7.2-7.4。过滤除菌加血清（终浓度 10）,四、细胞培养基本技术,1 贴壁生长细胞传代方法 a. 吸光培
8、养瓶中的培养液 b.加入1-2 mL 0.25的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准)静置2-10min(显微镜下动态监测) 。 c. 吸去胰蛋白酶液，加入培养液。 d. 吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。 e. 吸取细胞悬液，接种于新的培养瓶内。 f. 加适量新鲜培养液于新培养瓶内。 g. 将后者放入培养箱中培养。,2 细胞计数血细胞计数器：手工计数细胞Coulter计数仪：人工计数a.将计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上。b.将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间，然后静置3minc.镜下观察，计算板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。
9、然后按公式计算：细胞数/mL=四大格细胞总数/4104注意：镜下偶见有两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。,3. MTT法(3-(4, 5-二甲基噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴盐) 原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物(formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。DMSO能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比，再用酶标仪测定OD值MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒性试验、肿瘤放射敏感性实验等。,操作步骤a.100L单细胞悬液接种于96孔板(5104)。b.培养24h后，加药，设六个平行样。c.给药72h后，加入0.5mg/mL的MTT液(50L)；继续培养4h。d.吸出孔内培养液后，加入DMSO(200L)，然后微孔板扳荡器上振荡10分钟。e.酶标仪检测各孔OD值(检测波长570nm)抑制率=(1-给药组平均OD/对照组平均OD)100%,实验结果：,剂量 细胞抑制率(%) (g/mL) SGC-7901 HepG-2 1 -15.2 -19.9 50 72.0 56.9100 83.0 78.2150 82.9 79.5IC50分别为22.406 g/mL和31.429 g/mL,谢 谢,
