1、细胞培养基本技术细胞培养的甚本概念传代:细胞在培养器皿中生长一定时间后,被分开接种到新的培养器皿中.原代培养取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养.细胞培养:使用单个细胞悬液组织培养:使用组织块(O.51 立方毫米)或薄片( 厚 0.2 毫米)器官培养:使用器官原基或器官的一部分或整个器宫原代培养细胞的生命归宿原代培养期传代期衰退期有限细胞系,无限细胞系 细胞系 cell line细胞株 cell strain 培养细胞的特性培养细胞的生长方式贴附生长:必须贴附于支持物表面才能生长.见于各种实体瘤细胞悬浮生长:于悬浮状态下即可生长,不需要贴附于支持物表面.见于各种造血
2、系统肿瘤细胞每代贴附生长细胞的生长过程游离期贴壁期潜伏期对数生长期停止期(平台期)游离期:细胞接种后在培养液中呈悬浮 状态.也称悬浮期.此时细胞质回缩,胞体呈圆球形.10 分钟一 4 小时贴壁期:细胞附着于底物上,游离期 结束.细胞株平均在 10 分钟一 4 小时贴壁.底物:胶原,玻璃,塑料,其它细胞等血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素,胶原等糖蛋白(生长基质), 这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上,悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着.进口塑料培养瓶涂有生长基质(化学合成的功能基团)潜伏期此时细胞有生长话动,而无细胞分裂.细胞株潜伏期一般为 624 小时.对数生长期:细胞数随
3、时间变化成倍增长,活力最佳,最适合进行实验研究.停止期(平台期):细胞长满瓶壁后,细胞虽有活力但不再分裂机制:接触抑制,密度依赖性培养细胞生长的条件1 细胞的营养需要2 细胞的生存环境温度: 37 O2CO2: 5% CO2 +H2O H2CO3 H+ + HCO3-pH: 7.2-7.4渗透压3 无污染4 无毒实验准备实验用品:超净工作台,压力蒸汽消毒器,电热干燥箱,滤器,酸缸CO2 培养箱倒置显微镜酶标仪,微孔板震荡器液氮罐自动双重纯水蒸馏器,纯水仪耗材:培养瓶,吸管,电动吸引器 ,培养板, 冻存管压力蒸汽消毒器:湿热消毒,用途广电热干燥箱:干热消毒(160 ,2 小时). 主要用干玻璃器
4、皿消毒 滤器:过滤除菌:大多数培养用液,如人工合成培养基,血清, 酶液等均采用滤过法除菌 超净工作台:为细胞操作提供无菌环境紫外灯 :紫外线消毒. 主要用于培养室空气 ,操作台,塑料培养皿和培养板等表面消毒 超净台超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒,使空气得到净化.净化空气徐徐通过工作台面,使工作台内构成无菌环境. 滤 器CO2 培养箱CO2 培养箱设定的条件为 37 ,5%CO2 .使用 CO2 培养箱培养细胞时应注意的问题:用螺旋口瓶培养细胞时,需将瓶盖微松,以保证通气.保持培养箱内空气干净.定期消毒(90 ,14 h).箱内火菌蒸馏水 3000 毫升
5、蒸馏水槽中以保持箱内湿度,避兔培养液蒸发.自动双重纯水蒸馏器 纯水仪酶标仪 微孔板震荡器培 养 板培养瓶常用玻璃器皿清洗浸泡(自来水), 刷洗( 洗衣粉),酸泡(24 小时),流水冲洗,蒸溜水浸泡和冲洗,50烘干清洁液的配制2 细胞培养用液的配制水:新鲜配置的三蒸水或去离子水平衡盐溶液:无 Ca2+,Mg2+的缓冲液PBS:NaCl 8.0 gKCl 0.2 gNa2HPO4.H2O 1.56 gKH2PO4 0.20加水至 1000 ml消化液:胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健,除去细胞间粘蛋白及糖蛋白,影响细胞骨架,从而使细胞分离.胰蛋白酶液浓度越高,作用越强,但超过一定限度会损
6、伤细胞.胰蛋白酶是一种黄白色粉末,用无 Ca2+,Mg2+的 PBS 缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25% .用滤器过滤除菌.胰蛋白酶液消化时间:2-10 分钟.用含血清培养液终止其对细胞的消化作用 培养基培养基(培养液)是维持体外细胞生存和生长的溶液,分天然培养基和合成培养基 .天然培养基:天然培养基有血清,血浆,和组织提取液(如鸡胚和牛胚浸液).优点:营养成分丰富,培养效果好缺点:来源受限.成分复杂,影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析.易发生支原体污染 合成培养基合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量,用人工方法模拟合成的.目前已设计出许多种培养基,如 TC199,MEM
7、,RPMI-1640, DMEM 等.合成培养基主要成分是氨基酸,维生素,碳水化合物,无机盐和其它一些辅助物质.优点:标准化生产,组分和含量相对固定 .成本低 缺点: 缺少某些成分,不能完全满足体外细胞生长需要 . 人工合成培养基只能维持细胞生存,要想使细胞生长和繁殖,还需补充一定量的天然培养基(如血清).血清中含有:多种蛋白质( 白蛋白,球蛋白,铁蛋白等)多种金属离子; 激素 ;促贴附物质,如纤粘蛋白,冷析球蛋白,胶原等.各种生长因子转移蛋白不明成分一般说来.含 5%小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死.但支持细胞生长一般需加 10%血清.对于血清支持细因生长的生物学效应已得到证明,
8、但对血清中的复杂成分至今尚未完全清楚.血清中不仅存在促细胞生长因子,同对也存在细胞生长抑制因子或毒性因子,因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应.在生长因子,蛋白质工程,基因表达调控等研究领域,迫切需要用无血清培养基培养细胞.无血清培养基的主要研制策略:在基础培养基中补充各种必需因子,如激素,生长因子 ,结合蛋白 ,贴壁和扩展因子 等.无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组成.1975 年,Sato 首次成功地用无血清培养基培养了垂体细胞株,近 20 多年来已报道了几十种细胞系在无血清培养基中成功地生长和增殖.无血清细胞培养基的使用保证了实验结果
9、的准确性,可重复性和稳定性,减少了细胞污染,简化了提纯和鉴定各种细胞产物的程序.向无清培养液中能促进细胞系生长的补加物都是独特的.适用于某种细胞株的培养液,很可能不适合另一种细胞株的生长.即使同源组织的不同细胞株,所需补加物也不同. 无血清培养基尚处于研究阶段,难以推广.目前,绝大多数人工合成培养基使用时还需添加血清 血清质量好坏是实验成败的关键.常用血清有胎牛血洁,新生牛血清,小牛血情,兔血清,马血清等,其中以胎牛血清质量最好.优质血清的标准:透明,淡黄色 ,无沉淀物,无细菌,支原体,病毒污染.血清的灭活(消除补体活性):56 ,30 分钟血清的消毒:过滤除菌抗菌素的使用:在培养液配制后,培
10、养液内常加适量抗菌素,以抑制可能存在的细菌的生长.通常是青霉素和链霉素联合使用.培养基内青霉素,链霉素最终使用浓度为每毫升 100 单位.庆大霉素:每毫升 100 单位 方便,广谱,稳定完全培养基的组成基础培养基 80%一 95%血清 5%一 20%碳酸氢钠 2.0 g/L青,链霉素 各 100 卑位/毫升培养基的配制RPMI-1640 培养粉 1 袋碳酸氢钠 2.0 g青,链霉素 各 100 单位/毫升加三蒸水 至 1000ml, 过滤除菌.调节 pH 值至 7.2加血清(终浓度 10%)细胞传代方法根据细胞生长的恃点,传代方法有 3 种.1 悬浮生长细胞传代离心法传代:离心(1000 转/
11、分)去上清,沉淀物加新培养液后再混匀传代.直接传代法:悬浮细胞沉淀在瓶壁时 ,将上清培养液去除 l/2 一 2/3,然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代.2 半悬浮生长细胞传代(Hela 细胞)此类细胞部分呈现贴壁生长现象,但贴壁不牢,可用直接吹打法使纫胞从瓶壁脱落下来,进行传代.3 贴壁生长细胞传代采用酶消化法传代.常用的消化液有 0.25%的胰蛋白酶液.贴壁生长细胞传代方法:1 吸光培养瓶中的培养液2 加入 1-2 ml 0.25%的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准)静置 2-10 min(显微镜下动态监测).3 吸去胰蛋白酶液,加入培养液.4 用吸管吸取瓶内培养液,反复吹打瓶壁细胞
12、,形成细胞悬液.5 吸取 1/101/40 细胞悬液,接种于新的培养瓶内.6 加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内.7 将后者放入培养箱中培养.细胞计数血细胞计数器:手工计数细胞Coulter 计数仪 :人工计数培养细胞活力测定细胞活力测定是肿瘤体外研究中应用最广的技术手段之一._任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成,从形态上区别死,活细胞是困难的.1 细胞克隆形成率实验单个细胞在体外增殖 6 代以上,其后代所组成的细胞群体形成肉眼可见的克隆.克隆形成卒用来表示细胞的增殖能力 克隆形成率比=克隆形成数/接种细胞数缺点:操作繁琐优点:精确,可靠2 台盼蓝法活细胞不被染色,死细胞染
13、成蓝色,用活细胞占细胞中的百分比表示细胞恬力 已淘汰3 四唑盐(MTT)比色法四唑盐(MTT) 商品名为噻唑蓝,四吐盐比色法的原理:活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物(formazan),并沉淀在细胞中,而死细胞没有这种功能.二甲亚砜(DMSO) 能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物,溶液颜色深浅与所含的 formazan 量成正比.再用酶标仪测定 OD 值MTT 法简单快速,准确,广泛应用于新药筛选,细胞毒牲试验,肿瘤放射敏感性实验等.操作步骤(1)单细胞悬液接种于 96 孔培养板;103-104 细胞/孔,每孔培养基总量 200 微升(96 孔培养板每孔容积 370 微升),37
14、 ,5%CO2 培养箱中培养一段时间(根据实验目的决定培养时间)(2)加入 2 毫克/ 毫升的 MTT 液(50 微升/孔); 继续培养 3 小时 .(3)吸出孔内培养液后,加入 DMSO 液(150 微升/孔),将培养板置于微孔板扳荡器上振荡 10 分钟,使结晶物溶解.(4)酶标仪检测各孔 OD 值(检测波长 570 纳米).记录结果,绘制操作步骤(1)单细胞悬液接种于 96 孔培养板;103-104 细胞/孔,每孔培养基总量 200 微升(96 孔培养板每孔容积 370 微升),37 ,5%CO2 培养箱中培养一段时间(根据实验目的决定培养时间)(2)加入 2 毫克/ 毫升的 MTT 液(
15、50 微升/孔); 继续培养 3 小时 .(3)吸出孔内培养液后,加入 DMSO 液(150 微升/孔),将培养板置于微孔板扳荡器上振荡 10 分钟,使结晶物溶解.(4)酶标仪检测各孔 OD 值(检测波长为 570 nm).记录结果,绘制细胞生长曲线细胞冻存和复苏细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作.细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少入力,经费,减少污染,减少细胞生物学特性变化.冻存和复苏的原则:慢冻快融当细胞冷到零度以下,可以产生以下变化:细胞器脱水,细胞中可溶性物质浓度升高,并在细胞内形成冰晶.如果缓慢冷冻,可使细胞逐步脱水,细胞内不致产生大的冰晶;相反.结晶就大,大结晶会造成细胞膜,纲胞器
16、的损伤和破裂.复苏过程应快融,目的是防止小冰晶形成大冰晶,即冰晶的重结晶.慢冻程序标准程序:当温度在-25 以上时, 12 /min当温度达-25 以下时, 510 /min当温度达-100 时,可迅速放入液氮中细胞冻存器简易程序:将冷冻管(管口要朝上)放入纱布袋内,纱布袋系以线绳,通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口 ,按每分钟温度下降 12 的速度,在 40 分钟内降至液氮表面,停 30 分钟后,直接投人液氮中.低温保护剂的应用在细胞冻存时加入温保护剂,能大大提高冻存效果.常用的低温保护剂是 DMSO,它是一种渗透性保护剂,可迅速透入细胞,提高胞膜对水的通透性,降低冰点,延缓冻结过程,能使细胞
17、内水分在冻结前透出细胞外,在胞外形成冰晶,减少胞内冰晶,从而减少冰晶对细胞的损伤.细胞冻存方法1 预先配制冻存液: 含 20%血清培养基10% DMSO 2 取对数生长期细胞,经胰酶消化后,加入适量冻存液, 用吸管吹打制成细胞悬液(1106 5 106 细胞/ml)3 加入 1ml 细胞于冻存管中,密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期 .4 年后,存洁率可达 80%一叽 %.DMSO 液用培养液配好,避免因临时配制产热而伤害细胞.对人造血干细胞的研究证细胞复苏方法(l)从液氮中取出冷冻管,迅速投入 3738 水浴中,使其融化(1 分钟左右).(2)5 分钟内用培养液稀释至原体积的 10 倍以上.(
18、3)低速离心 10 分钟.(4)去上清,加新鲜培养液培养刚复苏的细胞.1：培养液 pH 值变化太快 可能原因(1)CO2 张力不对(2)培养瓶盖拧得太紧(3)NaHCO3 缓冲系统缓冲力不足(4)培养液中盐浓度不正确(5)细菌、酵母或真菌污染 建议解决方法(1)按培养液中 NaHCO3 浓度增加或减少培养箱内 CO2 浓度，2.0g/L 到 3.7g/L 浓度 NaHCO3 对应 CO2 浓度为 5%到 10%。(2)松开瓶盖 1/4 圈。(3)改用不依赖 CO2 培养液。加 HEPES 缓冲液至 10 到 25mM 终浓度。(4)在 CO2 培养环境中改用基于 Earles 盐配制的培养液，
19、在大气培养环境中培养改用 Hanks盐配制的培养液。(5)丢弃培养物，或用抗生素除菌。 问题 2：培养液出现沉淀，但 pH 值不变 可能原因(1)洗涤剂清洗后残留有磷酸盐，将培养基成分沉淀下来(2)冰冻保存培养液 建议解决方法(1)用去离子水反复冲洗玻璃器皿，然后灭菌。(2)将培养液加热到 37，摇动使其溶解如沉淀仍然存在，丢弃培养液。 问题 3：培养液出现沉淀，同时 pH 发生变化 可能原因细菌或真菌污染 建议解决方法丢弃培养物，或用抗生素除菌。 问题 4：培养细胞不贴壁 可能原因(1)胰蛋白酶消化过度(2)支原体污染(3)培养瓶瓶底不干净(4)培养液 pH 值过碱(NaHCO3 分解)(5
20、)消化液或培养液配制错误、过期储存、储存不当细胞老化(如传代前细胞已汇合导致失去贴附性)(7)接种细胞起始浓度太低或太高 建议解决方法(1)缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度。(2)分离培养物，检测支原体。清洁支架和培养箱。如发现支原体污染，丢弃培养物。(3)注意刷洗，或换用一次性塑料培养瓶(4)使用无菌醋酸溶液调整 pH 值或充入无菌 CO2(将培养液敞口放入培养箱也可)(5)重新配置消化液或培养液启用新的保种细胞(7)调节最佳接种细胞浓度 问题 5：悬浮细胞成簇 可能原因(1)培养液中含钙、镁离子(2)支原体污染(3)蛋白酶过度消化使得细胞裂解释(4)DNA 污染 建议解决方法(1)用
21、无钙镁平衡盐溶液洗涤细胞，轻轻吹吸细胞获得单细胞悬液。(2)分离培养物，检测支原体。如发现支原体污染，丢弃培养物。(3)用 DNase I 处理细胞。 问题 6：原代细胞培养物污染 可能原因原代培养组织在进入培养前已污染 建议解决方法培养前用含高浓度抗生素的平衡盐溶液反复冲洗组织。 问题 7：培养细胞生长减慢 可能原因(1)由于更换不同培养液或血清(2)培养液中一些细胞生长必需成分如谷氨酰胺或生长因子耗尽或缺乏或已被破坏。(3)培养物中有少量细菌或真菌污染(4)试剂保存不当(5)接种细胞起始浓度太低细胞已老化(7)支原体污染 建议解决方法(1)比较新培养液与原培养液成分，比较新血清与旧血清支持
22、细胞生长实验。让细胞逐渐适应新培养液。(2)换入新鲜配制培养液，或补加谷氨酰胺及生长因子。(3)用无抗生素培养液培养，如发现污染，丢弃培养物。或用抗生素除菌。(4)血清需保存在-5 到-20。培养液需在 2-8避光保存。含血清完全培养液在 2-8保存，并在 2 周内用完。(5)增加接种细胞起始浓度。换用新的保种细胞。(7)分离培养物，检测支原体。清洁支架和培养箱。如发现支原体污染，丢弃培养物。 问题 8：培养细胞死亡 可能原因(1)培养箱内无 CO2(2)培养箱内温度波动太大(3)细胞冻存或复苏过程中损伤(4)培养液渗透压不正确(5)培养液种有毒代谢产物堆积更多原因参考问题 4 和问题 7 建
23、议解决方法(1)检测培养箱内 CO2(2)检查培养箱内温度(3)取新的保存细胞种(4)检测培养液渗透压。注意：大多数哺乳动物细胞能耐受渗透压为 260 350 mOsm/kg。加入额外试剂如 HEPES 或药物都有可能影响培养液渗透压。(5)换入新鲜培养液站细胞培养常见问题 1. 液体培养基的保存是冷藏好？还是冷冻好？ 要冷藏！因为液体培养基经冷冻后再经溶化时，其溶液的 pH 值会发生改变，溶液往往变碱，某些成分溶解也会受到影响对细胞生长不利。故液体培养基一定要存放在冷藏箱中，通常液体培养基在冷藏条件下可存放 6 个月 一年。 2. 液体培养基中谷氨酰胺的作用，及使用方法。 几乎所有的细胞对谷
24、氨酰胺有较高的要求，细胞需要谷氨酰胺合成蛋白质，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。所以，各种培养液中都含有较大量的谷氨酰胺。谷氨酰胺在溶液中很不稳定，应置-20 C 冰冻保存，用前加入培养基中。加有谷氨酰胺的液体培养基 4 C 冰箱储存两周以上时，应重新加入原来量的谷氨酰胺。基础医学细胞中心在其服务项目中配制分装了高浓度（100 倍）的谷氨酰胺溶液（1ml/ 支） 。每支 1ml 的谷氨酰胺加到 99ml 完全培养基中，其终浓度为 2mM/ml 培养基。包装为粉红色，-24C 保存。 3.培养用液 pH 对细胞生长的影响 由于，大多数细胞适宜 pH 为 7.27.4，偏离此范围对细胞将产生
25、有害的影响。各种细胞对 pH的要求也不完全相同，原代培养细胞一般对 pH 变动耐受差，无限细胞系耐受力强。 但总体来说，细胞耐酸性比耐碱性强一些，偏酸环境中更利于细胞生长。因此，我们在配制培养用液时，可把液体的 pH 稍微调得偏酸一些。液体在经过 0.10um 或 0.22um 滤膜过滤时，溶液的 pH 还会向上浮动 0.2 左右。 4.常用培养基及培养用液的渗透压范围 培养基名称 渗透压范围（mOSM） DMEM（高糖） 315 350 DMEM（低糖） 270 330 RPMI-1640 260 290 MEM-EBSS 280 310 MEM-NEAA 280 310 McCoy5a 2
26、80 310 MEM-a 280 310 M199 275 305 IMDM 270 300 DMEM/F-12 280 310 F10 270 300 F12 275 300 培养基名称 渗透压范围（mOSM） L15 280 320 D-Hanks 280 300 Hanks 280 300 PBS 275 300 5.细胞传代消化时所用胰酶浓度越高越好吗？ 不见得！因为胰蛋白酶溶液的消化能力是和溶液的 pH、温度、胰酶浓度及溶液中是否含有Ca+, Mg+离子和血清等因素有关。通常情况下， pH 8.0 , 温度 37 oC 其作用能力最强。另外，钙、镁离子及血清均能大大降低其消化能力。我
27、们每次进行传代消化前，一定要用 D-Hanks 液或 PBS 液反复冲洗细胞培养瓶，以便于将含血清的培养基冲洗干净，这样就能大大提高消化液的消化能力。本中心通常使用的消化液浓度为： （1）.胰蛋白酶.； （2）.胰蛋白酶.。 （3）0.25% 胰蛋白酶 溶液.；使用液配制。 多数细胞传代消化可使用.胰蛋白酶.这种消化液。 6.培养基在使用过程中应注意的问题： （1）. 培养基在使用前需 37 oC 预热或在室温平衡后再使用。 （2）. 细胞培养过程中，吸取过培养液的吸管不能再用火焰烧灼，防止残留在吸管内的培养基焦化，将有害物质带入培养液中。 （3）. 尽量缩短各种液体、细胞的暴露时间。 （4）
28、. 避免液体间、细胞间的交叉污染。 （5）.配制完全培养基时，配制的量最好在 2 周内用完为好。 7.血清的有关问题： 新生牛血清：新出生牛 5 天内取血制成 小牛血清：小牛出生 16 周以内采血制成。 胎牛血清：（进口血清）要求剖腹取胎制成。 国内厂家往往不能做到，经常把出生 2 天以内采血称为胎牛血清。 根据血清的生产工艺及血红蛋白、内毒素含量又分为： （1）.特级胎牛血清：40 纳米过滤，内毒素含量10EU， 血红蛋白含量10mg/dl。 （2）.优等胎牛血清：经过 3 次 100 纳米过滤， 内毒素含量25EU/ml， 血红蛋白含量25mg/ml。 （3）.标准胎牛血清：3 次 100
29、 纳米过滤，低内毒素， 低血红蛋白含量。 （4）.活性碳/葡聚糖处理血清：激素含量大大降低。 （5）.透析型胎牛血清：次黄嘌呤和胸腺核苷含量大大降低。 8. 其他细胞培养用液：除培养基、血清、谷氨酰胺外，其他几种液体也属必须，不可省略。 （1）.双抗：200 倍， （1ml/支）其终浓度为青霉素 100U/ml；链霉素 100ug/ml，-24 oC 保存。 （2）.L-谷氨酰胺：100 倍， （1ml/ 支） ， 终浓度 2mM，-24 oC 保存。 （3）.丙酮酸钠：配制浓度 50mM，4ml/支，终浓度为 1mM/ml， -24 oC 保存。 （4）.Hepes 液：配制浓度 1M（5m
30、l/ 支） ，一支 Hepes 加入到 200ml 完全培养基中，终浓度为 25mM/ml，常温保存。 9.支原体污染及检测： （1）.支原体污染在细胞培养中最常见、不易被查觉，但支原体污染可显著影响细胞功能干扰实验结果。支原体是介于细菌和病毒之间的目前所知能独立生活的最小微生物，它无细胞壁，形态呈高度多形性，最小直径 0.2um，可通过滤器。 目前中心通过对国内 100 余株/系细胞的检测，形势不容乐观。污染率达 30% 60% 。课题组从国外引进细胞株/系也经常出现支原体的污染。支原体在污染细胞后，它通过影响细胞的DNA、RNA 的合成及急速消耗培养基中的氨基酸来抑制细胞的生长，并能降低细
31、胞的融合率。因此，在运用各种细胞系进行实验研究时，首先要证明所用细胞有无支原体的污染。 （2）.支原体污染后，培养基可不发生浑浊，细胞病变轻微或不明显，因此难以发现。目前，支原体检测的方法有以下几种。 （a）.相差显微镜观察；（b）.低张处理地衣红染色法； （c）.荧光染色法；（d）.酶标法； （e）.PCR 法：基础医学细胞中心使用该方法进行检测。 优点：灵敏度高，检测耗时短，样品量小 （只需 50ul 细胞培养用液上清） 。 缺点：引物及制剂费用较高。 实验一 动物细胞培养细胞培养是用无菌操作的方法将动物体内的组织(或器官)取出,模拟动物体内的生理条件,在体外进行培养.使其不断地生长,繁殖
32、,人们借以观察细胞的生长,繁殖,细胞分化以及细胞衰老等过程的生命现象.细胞培养的突出优点,一是便于研究各种物理,化学等外界因素对细胞生长发育和分化等的影响;二是细胞培养便于人们对细胞内结构 (如细胞骨架等),细胞生长及发育等过程的观察.因而细胞培养是探索和指示细胞生命活动规律的种简便易行的实验技术,同时我们也不可忽略的另一个因素,那就是它脱离乐生物机体后的些变化.细胞培养技术目前已广泛地被应用于生物学的各个领域.如分子生物学,细胞生物学,遗传学,免疫学,肿痛学及病毒学等为此有必要使学生在细胞培养方面得到一些初步的感性知识,了解动物细胞培养的基本操作过程,观察体外培养细胞的生长特征,对原代细胞与
33、传代细胞有一个基本概念.本实验分两次进行.即清洗与消毒和传代细胞的培养与观察.清洗与灭菌一,实验目的能独立地进行用于细胞培养的各种器皿的清洗与消毒,掌握干热灭菌法,湿热灭菌法和滤过除菌法的操作,了解化学消毒法的使用方法.二,实验原理清洗与消毒是组织培养实验的第一步,是组织培养中工作量最大,也是最基本的步骤.体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌的要求程度很高.细胞养不好与清洗不彻底有很大关系.清洗后的玻璃器皿,不仅要求干净透明,无油迹,而且不能残留任何物质.如有毒的化学物质,哪怕残留 0.1 个,也可能影响细胞生长.灭菌手段的选择十分重要,对不同的物品需采用不同的灭菌方法.假如选用
34、的方法不对,即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值,生物学特性或其他使用价值也不行.以下在每种灭菌步骤中都介绍其使用范围.三,实验材料,用品材料:无臭氧型紫外灯,微孔滤膜 (直径 25):孔径为 0.22m,微孔滤膜(直径 90):孔径为 0.22 m,过滤器(直径 25).药品:70%或 75%酒精,0.1% 新洁尔灭 ,煤酚皂溶液(来苏儿水),0.5%过氧乙酸,乳酸,37% 甲醛,高锰酸钾,NaOH,盐酸,重铬酸钾,浓硫酸( 工业),DEPC 水体积分数 0.1%的焦炭酸二乙酯(diethylpyroearbonate).仪器:超净台,干燥箱,高压锅,过滤器 ,过滤泵.四,实验步骤(一
35、)清洗1.新玻璃器皿的清洗先用自来水刷洗,再浸泡 5%稀盐酸以中和玻璃表面的碱性物质和其他有害物质.2.使用过的玻璃器皿的清洗(1)使用过的培养用品应立即浸入清水,避免干涸难洗.(2)用洗涤剂清洗玻璃器皿,自来水清洗数遍,倒置自然干燥 .(3)浸酸性洗液过夜.(4)从酸性洗液捞出后自来水冲洗 10.15 次去除残余酸液,蒸馏水涮洗 3 次,倒置烘干. (5)包装(牛皮纸或一般纸 ). (6)高压(15 磅 20 min)或干热(170 2 h)灭菌.(7)贮存备用. 3.胶塞的处理 (1)新胶塞应先用清水清洗之后再用 0.2%NaOH 煮沸 lO-20 min. (2)自来水清洗 10 次.
36、(3)再用 1%稀盐酸浸泡 30 min. (4)自来水清洗 10 次,蒸馏水涮洗 3 次.晾干,高压灭菌( 见(二)消毒与灭菌). 旧胶塞不必用酸碱处理可直接用洗涤剂煮沸和清洗数次,过蒸馏水,晾干,包装并高压灭菌后,便可使用.(二)消毒1.物理消毒法 (1)紫外线消毒 用于消毒空气,操作台面和一些不能用干热,湿热灭菌的培养器皿,如塑料培养皿,培养板等.这是常使用的消毒方法之一. (2)干热灭菌 主要用于玻璃器皿的灭菌.将用于细胞培养的器皿放人干燥箱内,加热至 160,保温 90-120 min.用于 RNA 提取实验的用品则需 180,保温 5-8 h. (3)湿热灭菌 此方法也称为高压蒸汽
37、灭菌,是最有效的一种灭菌方法.主要应用范围是布类,橡胶制品(如胶塞),金属器械,玻璃器皿,某些塑料制品以及加热后不发生沉淀的无机溶液 (如Hanks 液 ,PBS,20SSC 等).手动高压灭菌锅操作如下: 首先查看高压锅内的水是否充足,放人物品盖好盖.加热高压锅.将放气阀打开,放气 510 min,以排除锅内的冷空气 . 待锅内水沸腾后,落下放气阀继续升温升压,玻璃器皿等用 15 磅(121)30 min,胶塞,塑料制品,溶液等可用 10 磅(115 )20 min.调节火力大小保持该压力.停止加热 ,待压力自然下降至 0 再打开放气阀排汽,开盖,取出高压灭菌的物品烘干. 电热自动灭菌锅使用
38、说明(型号 :SANYO Autoclave MLS-3020): 放气筒加水至 LOW 水平线处,将与高压锅相连的导气管插入放气筒里,然后将放气筒归于原位. 打开高压锅盖,加入蒸馏水至高压锅底的水位线,水位线位于 V 型凹槽的 1/3-2/3 处. 打开电源 . 设定高压温度及时间,高压锅的温度范围为 105-121,高压灭菌一般采用 1212030 min. 把待高压的物品置于高压锅内,顺时针方向将 exhaust 钮旋至 close 位置. 关闭高压锅盖,旋至显示屏上左上角的红亮点刚出现为止.按 start 钮,开始高压,在温度达 80时显示器开始显示温度,当温度达到所需的设定温度时,在
39、显示屏的左下角有一长形的指示灯闪亮,直到高压时间结束后指示灯灭,此时蜂鸣器报警一声.当压力降至 0 MPa 时,蜂鸣器再报警一声.温度降至 80时,蜂鸣器报警 10 次.显示屏温度指示消失,此时才可打开锅盖. 关电源 ,开高压锅盖 ,取出已灭菌的物品,烘干. (4)滤过除菌 用于培养用液和各种不能高压灭菌的溶液的灭菌.采用金属滤器和小型的塑料滤器,配上可以更换的微孔滤膜,极大地方便了操作.滤器型号按直径大小划分.如过滤量大的培养用液常用较大型号的金属滤器(直径 90 mm,100 mm,142 mm等), 配以过滤泵使用.过滤量较小的液体常用注射器推动的塑料小滤器(直径 20 mm,25 mm
40、 等). 滤膜孔径有 0.60 m,0.45 m,0.35 m,0.22 m,0.10m 等,以 0.22 m 除菌最为保险,但对于较粘稠难滤过的液体,仍需选用孔径较大的滤膜.在过滤器上装上微孔滤膜,孔径为 0.22m.用布包好 ,湿热灭菌后使用. 2.化学消毒法 常用的消毒液有如下几种:(1)70%(或 75%)酒精: 超净台里常备 70%酒精棉球(卫生级酒精), 用于手和一些金属器械或工作台面的消毒.(2)0.1%新洁尔灭 :主要用于手和前臂的清洗以及工作后超净台面的清洁 .超净台旁应常备盛有 0.1%新洁尔灭溶液的容器及纱布 . (3)来苏儿水(煤酚皂溶液 ):主要用于无菌室桌椅 ,墙壁
41、,地面的消毒和清洗,以及空气喷撒消毒,特别是污染细胞的消毒处理.使用浓度请按瓶上说明. (4)0.5%过氧乙酸 :是强效消毒剂,10 min 即可将芽孢菌杀死.用于各种物品的表面消毒,用喷撒和擦拭方式进行. (5)乳酸蒸气:将乳酸放入坩锅内用酒精灯或电炉加热至沸腾为止.将门窗紧闭 13 d.可将空气中漂浮的微生物杀死. (6)37%甲醛加高锰酸钾:使用前先紧闭门窗.将 37%甲醛用酒精灯或电炉加热至沸腾后断电或灭火.用一张纸盛好适量的高锰酸钾,迅速放人已加热好的甲醛中形成蒸气.13 d 后方可达到消毒空气的目的. 3.煮沸消毒 急性消毒可用煮沸法,器械等煮沸 15 min 后使用 . 五,注意
42、事项1.清洗玻璃制品时,浸酸之后一定要用自来水冲洗 1015 次.因为残存的洗液对细胞粘附有很大影响.清洗塑料制品时要用棉花或柔软纱布擦洗.千万不要用硬毛刷,否则损害塑料表面后细胞不易贴壁.Tip 和 Tube 一定要用超声清洗处理后逐个清洗.如没有洗净会影响下一次使用的效果. 2.干热灭菌时,应在白天使用烤箱,并不断观察,以免发生意外.当温度超过 100时,不能再打开烤箱门.器皿烤完后,待温度降至 100之下才能开烤箱门.金属器械和橡胶,塑料制品不能使用干热灭菌方法 3.高压灭菌后器皿务必晾干或烘干,以防包装纸潮湿发霉.4.牛血清,大部分培养基,胰酶和一些生物制剂是有机溶液,均不能高压(如
43、TdR,秋水仙素,谷氨酰胺,异硫氰酸胍,MOPS 等).5.滤过除菌时,滤器在使用前先装好滤膜(有时可在上面加一层定性滤纸), 包好,经高压灭菌后才能使用.滤过酶类制剂时应待滤器温度降至室温下再进行.过滤时压力不宜过大,压力数字以 2 为宜.压力太大时微孔滤膜可能破裂,或使某些微生物变形而通过滤膜.装滤膜时位置要准确.另外滤器包装时,螺钉不要拧得太紧,以防高压蒸汽不能进入,待高压灭菌之后,再拧紧使用. 6.使用化学消毒法时,配制 75%酒精应用卫生级,不要用化学纯,分析纯和优质纯酒精.来苏儿水不能用于皮肤消毒,它对皮肤有刺激性.空气消毒时,所有的物品要事先准备齐全并使消毒者有较方便的退出途径.
44、因为甲醛或乳酸加热后放出的蒸气对人的角膜和呼吸道上皮有严重的刺激和伤害作用. 六,思考题1.哪些物品适合于高压灭菌,并说明理由.2.紫外线消毒的适用范围和目的是什么 II,传代细胞培养与观察一,实验目的了解传代细胞的传代方法及操作过程,学习观察体外培养细胞的形态及生长状况二,实验原理传代培养是指细胞从一个培养瓶以 1:2 或 1:2 以上的比例转移 ,接种到另一培养瓶的培养.这种培养,第一步也是制备细胞悬液,当细胞长成致密单层时,它很容易被蛋白水解酶和EDTA)所破坏 .所以般采用胰蛋白酶和 EDTA(乙二胺四乙酸盐 )的混合物,做为消化液.细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术.要
45、使细胞能在体外长期生长,必须满足两个基本要求:一是供给细胞存活所必需的条件 ,如适量的水,无机盐,氨基酸,维生素,葡萄糖及其有关的生长因子,氧气,适宜的温度,注意外环境酸碱度和渗透压的调节.二是严格控制无菌条件.三,实验用品1,器材解剖剪,解剖镊,眼科剪(尖头,弯头 ),眼科镊(尖头,弯头), 培养皿,量筒,试管,锥形瓶,吸管,橡皮头,培养瓶(小方瓶或中方瓶)等.上述器材均须彻底清洗,烤干, 包装好,9.9xl04Pa(15 磅)灭菌 30min备用.此外,还有显微镜,血细胞计数器,血细胞计数板,酒精灯,酒精棉球,碘酒棉球,试管架,标记笔,解剖板等.2,试剂L 磷酸盐缓冲液(PBs)无钙,镁溶
46、液细胞消化液:o.5%胰蛋白酶和 o.4%EDTAEMEM 液3%谷氨酰胺o.5%台盘蓝染液等3,材料喉癌细胞四,实验方法在做传代细胞培养之前,首先将培养瓶置于显微镜下,观察培养瓶中细胞是否已长成致密单层,如已长成单层,即可进行细胞的传代培养.1.营养液配制:EMEM 液 90%犊牛血清 10%双抗(1 万单位/m1) 加至约 100 单位/m1 3%谷氛酞胺 1m17.4%NaHCO3 调 pH 至 6.87.0 2.换液:在酒精灯旁打开瓶塞,倒去瓶中的细胞营养液.3.消化与分装在上述瓶中加入 1mlEDTA 溶液,轻轻摇动,将溶液倒出.重复上述动作.加入适量消化液(0.02%EDTA 或
47、0.04%EDTA1ml 十 o.5%胰蛋白酶液 0.2ml)以盖满细胞为宜,置于室温,停留12min 后,翻转培养瓶,肉眼观察细胞单层是否出现缝隙(针孔大小的空隙),如出现缝隙,即可倒去消化液;如末出现缝隙,则可将瓶翻回 ,继续进行消化,直到出现缝隙为让.此时,可倒去消化液,加入新配制的营养液 20m1.然后用吸管吸取培养瓶中的营养液,反复吹打瓶壁上的细胞层至瓶壁细胞全部脱落下来为止.此时,可继续轻轻地吹打细胞悬液,以使细胞散开.随之进行分装.4.培养分装好的细胞瓶上,做好标志,注明细胞代号,日期.置于培养架上,轻摇使细胞均匀分布,以免堆积成团.然后置于 37培养.5.观察(1)观察体外培养
48、细胞的几个问题;细胞培养 24h 后,即可进行观察,观察的重点如下:A.首先要观察培养细胞是否污染 .主要观察培养液颜色的变化及混浊度B.观察培养姬颜色变化及细胞是否生长.C.如细胞已生长,则要观察细胞的形态特征并判断其所处的生长阶段.观察时可参照(2)的描述进行.D.观察完毕,可用台盘蓝染液对细胞进行染色 .以确定死,活细胞的比例.(2)细胞的生长阶段及其形态特征传代培养的细胞需逐日进行观察,注意细胞有无污染,培养液颜色的变化及细胞生长的情况.般中层培养的细胞,从培养开始,经过生长,繁殖,衰老及死亡的全过程.它是一个连续的生长过程,但为了观察及描述,人为地将具分为 5 个时期,但各期间无明显
49、绝对界限.现分别描述如下:A.游离期:当细胞经消化分散成单个细胞后,由于细胞原生质的收缩相表面张力以及细胞膜的弹性.所以,此时细胞多为圆形,折光率高,此期可延续数 h.B.吸附期(贴壁):由于细胞的附壁持性,细胞悬液静置培养一段时间(约 78h)后,便附着在瓶壁上(此期不同细胞所需时间不同). 在显微镜下观察时可见瓶壁上有各种形态的细胞 ,如圆形,扁形,短菱形.细胞的特点,大多立体感强,细胞内颗粒少,透明.C.繁殖期:培养 l2h 以后直到 72h,细胞进入繁殖期,加速了细胞生长和分裂.此期包括由几个细胞形成的细胞岛(即由少数细胞紧密聚集而呈现的孤立细胞群,常散在地分布在瓶壁上), 到细胞铺满整个瓶壁(即所谓形成细胞单层 )的过程.此期细胞形态为多角形 (呈现上皮样细胞的特征).细胞特点:透明,颗粒较少,细胞间界限清楚,并可隐约见到细胞核.根据细胞所占瓶壁有效
