1、一、基础知识-蛋白质提取和分离原理,蛋白质提取与分离的依据蛋白质的物理化学性质：,形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、 亲和力等千差万别。,（1）原理：（2）材料,大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快； 小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。,多孔性的多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。,(一)凝胶色谱法,（3）分离过程,洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。,(一)凝胶色谱法,(一)凝胶色谱法, 凝胶色谱法（分配色谱法）：,1、什么是凝胶？,2、什么是凝胶色谱法？,学生活动2:,3、凝胶色谱法的原理是什么？,4、请用自己的话总结出凝胶色谱法分离相对
2、分子质量不同蛋白质的具体过程。,由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成。 如H2CO3/NaHCO3，醋酸/醋酸钠，NaH2PO4/Na2HPO4等,缓冲溶液洗脱剂 组成：配制：作用：,调节缓冲剂的比例，可配制不同pH的缓冲液。,抵制外界酸碱对溶液pH的干扰而保持 pH稳定。,（二）、缓冲溶液,1 、什么是电泳？,2、 影响电泳迁移速度的因素有哪些？,学生活动4:,4、电泳分离各种分子的原理是什么？,（三）、电泳,3、 如何消除电荷对电泳迁移速度的影响？,5 、请描述电泳的过程？,2凝胶电泳法：,（1）原理：,不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同， 在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同， 导致
3、不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。,影响蛋白质分子运动速度的因素,(三)电泳,1.电泳的概念,指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程.,影响蛋白质分子运动速度的因素,在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电； 加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。,（2）分离方法：（3）分离过程：,琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。,(三)电泳,二、实验操作,蛋白质的提取和分离一般分为四步： （1）样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋白释放；离心分离等操作收集到的血红蛋白溶液。 （2）粗分离：透析除去分子较小的杂质。 （3）纯化：通过凝胶色谱法将分子量
4、较大的杂质蛋白质除去。 （4）纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。,（一）样品处理,1、红细胞的洗涤： 目的是去除杂蛋白。要加入柠檬酸钠防止血液凝固；离心将血液分层，用胶头吸管吸出黄色血浆；用生理盐水洗涤。 2、血红蛋白的释放： 在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放 3、分离血红蛋白溶液： 离心分层；滤纸过滤去除脂溶性沉淀层；分液漏斗分出红色透明液体。 4、透析：装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（PH为7.0）透析。,二、实验操作,血液组成成分,阅读思考： 血液由_和_两部分组成。 血细胞中_细胞数量最多，红细胞的含量最高的有机化合物是_。 该化合物是由 _和_构成的，其中每个亚基中都含有一个能
5、与O2和CO2结合的_基团。,课题3 血红蛋白的提取与分离,返回,1.洗 涤 红 细 胞,阅读思考：洗涤的目的是什么？ 洗涤过程：,血液 100mL,重复洗涤3次，直至上清液没有黄色,课题3 血红蛋白的提取与分离,初次离心后的结果,3次洗涤后的结果,返回,2.释放血红蛋白,阅读思考： 释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？ 为了加速释放过程，采取了什么措施？,目的分析： 蒸馏水的作用是_。 加入甲苯的作用是_。 充分搅拌的目的是_。,使红细胞大量吸水胀裂,溶解红细胞的细胞膜,加速红细胞的破裂,课题3 血红蛋白的提取与分离,(2)血红蛋白的释放：,加蒸馏水到原血液体积，再加40体积
6、的甲苯 ，置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白。,3.分离血红蛋白,分离过程,红细胞 混合液,烧杯,课题3 血红蛋白的提取与分离,(3)分离血红蛋白溶液：,过程：将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10 min。试管中溶液层次：第1层（最上层）：甲苯层（无色透明）；第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）；第3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色透明液体）；第4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）。分离：用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。,甲苯层（无色透明）,白色薄层固体,红色透明
7、液体,杂质沉淀层（暗红色）,试管中溶液层次,返回,课题3 血红蛋白的提取与分离,4.透析血红蛋白,利用透析袋透析,课题3 血红蛋白的提取与分离,纯化凝胶色谱操作,1.凝胶色谱柱的制作：,2.凝胶色谱柱的装填：,教材图519,3.样品的加入和洗脱,（二）凝胶色谱操作,（1）凝胶色谱柱的制作： 取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。底塞的制作：打孔挖出凹穴安装移液管头部覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。顶塞的制作：打孔安装玻璃管。组装：将上述三者
8、按相应位置组装成一个整体。安装其他附属结构。,材料：交联葡聚糖凝胶G-75；20mmol/L磷酸缓冲液 装填:,课题3 血红蛋白的提取与分离,2.凝胶色谱柱的装填：,立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h,洗涤平衡,一次性缓慢倒入；轻轻敲打,装填悬浮液,凝胶颗粒洗脱液沸水浴,凝胶颗粒蒸馏水充分溶胀,根据色谱柱体积计算凝胶用量,色谱柱垂直固定在支架上,配制悬浮液,计算称量凝胶,固定色谱柱,（2）凝胶色谱柱的装填,凝胶的选择：A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。B、代表意义：“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。凝胶的前处理：配制凝胶悬浮液：计
9、算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。 凝胶色谱柱的装填方法：A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。B、装填：将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。 2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。,洗涤平衡：装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12小时。注意：1、洗脱液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物
10、质的分离效果。2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。,3.样品加入与洗脱,调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。洗脱：小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）注意：正确的加样操作：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。,3.样品的加入和洗脱,3.样品加入与洗脱,注意：正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。,收集得到的纯化后的血红蛋白,课题3 血红蛋白的提取与分离,注意事项,1. 红细胞的洗涤：洗涤次数不能过少；低速、短时离心。 2. 凝胶的预处理：沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡 3. 色谱柱的装填：装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。 4. 色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。,
