1、例题：例1.回答有关蛋白质分离和纯化的问题(1)要获得血清蛋白的粗制品，必须将含有柠檬酸钠的血液进行 处理，然后将 装入透析袋中除去 。(2)要获得血红蛋白，应如何破碎红细胞？ 。(3)下图为血清蛋白通过醋酸纤维薄膜的电泳图谱，你认为含量最多的蛋白质 是,含负电荷最多的球蛋白是 ,相对分子质量最大的球蛋白HR ，7球蛋白球ar白 一-F49，H inUI博生-M点样位(4)电泳是目前应用最为普遍的 蛋白质的方法。【解析】本题考查蛋白质分离和纯化的基础知识。【答案】(1)离心 上清液小分子物质(2)加蒸储水使其胀破(3)清蛋白 1-球蛋白丫-球蛋白(4)(分离)纯化例2.在遗传病及刑侦破案中常需
2、要对样品 DNA进行分析，PCR技术能快速扩增 DNA片段， 在几个小时内复制出上百万份的 DNA拷贝，有效地解决了因为样品中 DNA含量太低而难 以对样品进行分析研究的问题。据图回答相关问题：a 链TC-3,5 -G-G-0H (引物 1 )b 3，-C-Ca_UT (引物)95七|GTCT，3CC A-GT55 V IS-GGOH事一仃一6TC3 31CCaG-5,72七I(1)在相应的横线上写出引物n,并在复制这一步骤中将引物n置于合适的位置。(2)在相应的横线上写出循环一次后生成的DNA分子。(3)若将作为原料的四种脱氧核甘酸用 32P标记，请分析循环一次后生成的 DNA分子 的特点：
3、 ,循环n次后生成的 DNA分子中不含 放射性的单链占总单链的比例为 。(4) PCR反应过程的前提条件是 , PCR技术利用DNA的 原理解决了这个问题。(5)在对样品DNA进行分析的过程中发现，DNA掺杂着一些组蛋白，要去除这些组蛋白可加入的物质是。【解析】(1) DNA聚合酶不能从头开始合成 DNA,只能从3端延伸DNA链，所以 引物就提供了 3端，子链延伸方向为 5 - 3,引物I与b链部分碱基互补，引物H则与 a链部分碱基互补，且连接到a链白3 3端，故引物n的结构为 5, -G-A-OH ,复制结果为：5, -G-GT-C-3HOA G5(2)经过一次循环后，产生的两个DNA分子分
4、别含有引物I和引物H。(3)由于作为原料的四种脱氧核甘酸被32P标记，所以新合成的子链均含有放射性，一次循环后的两个 DNA各有一条链含32P,若复制n次，共产生子链2 nX2,其中只有DNA 母链不含32P,则其所占比例为2/ (2n 2) =1/2n.(4) DNA复制是以两条母链为模板，按照碱基互补配对原则进行的。因此，首先要解 旋，使两条母链的碱基暴露出来，才能按照碱基互补配对的原则把相应的碱基一个个地连接 起来。只有解旋后，再以母链为模板合成一小段引物，引物才起作用。DNA分子在80c100c的温度范围内变性，双链解开成单链，当温度慢慢降低时， 又能重新结合形成双链。(5)本题考查了
5、 DNA中杂质蛋白质的去除，利用酶的专一性，应加入蛋白酶。【答案】(1) 5 , G A OHHOA G5O,TCT 3- C-CA i 72 V A-G-5r 5一G-GTC3 3, CCAG-5,(3)每个DNA分子各有一条链含32P1/2n(4) DNA解旋 热变性 (5)蛋白酶例3.红细胞含有大量的血红蛋白，红细胞的机能主要是由血红蛋白完成，血红蛋白的主要功能是携带氧气或二氧化碳，我们可以选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液进行实验，来提取和分离血红蛋白，请回答下列有关问题：(1)血红蛋白提取和分离的程度可分为四步： 、和。(2)实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器中预先加入柠檬酸钠，取
6、血回来，马上进 行离心，收集血红蛋白溶液。加入柠檬酸钠的目的是 。该过程即样品处理，它包括 、收集血红蛋 白溶液。(3)收集的血红蛋白溶液在透析袋中可以经过透析，这就是样品的粗分离。透析的目的是 。透析的原理是 。(4)然后通过凝胶色谱法将样品进一步纯化，最后经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。样品纯化的目的是。血红蛋白有什么特点？ 。这一特点对进行蛋白质的分离有什么意义 。【解析】(1)血红蛋白提取和分离的程度可分为样品处理；粗分离；纯化；纯度鉴定四步；(2)柠檬酸钠是一种抗凝剂，能够防止血液的凝固；(3)透析袋实际上是一种半透膜，允许小分子物质自由通过，大分子不能出去，从而除去溶液中
7、的小分子物质；血红蛋白因含有血红素而呈现红色，使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。【答案】(1)样品处理；粗分离；纯化；纯度鉴定(2)防止血液凝固红细胞的洗涤，血红蛋白的释放(3)去除分子质量较小的杂质透析袋能使小分子自由进出，而大分子则 保留在袋内(4)通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去血红蛋白呈现红色， 在凝胶色谱分离时，可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液使血红蛋白的分离 过程非常直观，大大简化了实验操作。模拟试题：1 .如图为一种核酸分析方法，请据图分析回答有关问题。娥标记的泳动和植分析 i/的材料攘释性从八成底处断ff,随机出现4科低 标记片段！9 V
8、J ! tJ A ACi A j JC T 螃专户19包3J 一软 2 5、口四人2江山*& m AWA j ; I在器股介唐匕不同桓度的l)MA片段通过电泳 而分篇开，带粽记的片段宜就整示明在位置(1)被分析的材料应属于一条 链。如果它存在另一条互补链，该互补链的 碱基序歹”是 。(2)如果选择性断开的位置是碱基G,那么随机出现的被标记片段应有 种，在电泳带上被分离的显示位置应有 处，在泳动方向的最前端的片段是 序列 段，与图示泳动位置相比， 在同样电泳条件下该片段应位于的 (填“上方”或“下 方”)。电泳方向和片段显示位置口 TAGc一断开的位置(3)应用上述原理分析了某种未知序列核酸的一
9、条单链，结果如图所示，此结果说明,该核酸的此单链含 个核甘酸，其A: T: G: C=,同时也可推断其碱基 序列是：。2 .近十年来，PCR技术(多聚酶链式反应)成为分子生物学实验室里的一种常规手段，其原理是利用DNA半保留复制，在试管中进行DNA的人工复制(如图)，在很短的时间内,将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，使实验所需要的遗传物质不再受限于活的生物体。DNAW&单寡核普酸引核警酸连接 两个克的电 马DNA糖影 到口也月单够上 倭口M八分子 脏配对箝构(1)PCR技术能把某一 DNA片段进行扩增，依据的原理是:(2)加热使DNA双链打开，这一步是打开 键，称为,在细胞中是在的作用下使此键
10、断裂。(3)当温度降低时，引物与模板 端结合，在DNA聚合酶的作用下，引物沿模板延伸，最终合成2个DNA分子，此过程中加入四种脱氧核甘三磷酸的目的是,遵循的原则是。(4) PCR技术的必要条件，除了模板、原料、ATP、酶以外，至少还需要三个条件.即: 液体环境、适宜的 和。(5) PCR一般要经历三十多次循环， 每次循环可分为 、三 个步骤。3 .有4瓶失去标签的无色透明液体。已知各装有：大肠杆菌超标的自来水，丙种球蛋白溶液(一种抗体)，溶解着DN肪子的2mol/L的氯化钠溶液，葡萄糖溶液。请根据提供的第一步鉴定方法，简要写出用相应物质进行鉴定的其余步骤和结果。第一步：各取4种液体少许分别倒入
11、4个试管中，缓慢加入蒸储水并用玻璃棒搅拌，则第二步:除上述鉴定 DNA的方法外，还可以用哪些方法进行鉴定？ 4 .以下是有关DNA粗提取实验的阅读材料：A.核酸极不稳定，在较为剧烈的化学、物理因素和酶的作用下很容易降解。在制备DNA时要加入DNA酶的抑制剂柠檬酸钠，以除去 Mg,防止DNA酶的激活。B.核酸中的 DNA和RNA在生物体内均以核蛋白的形式存在， DNA核蛋白在1mol/LNaCl 溶液中溶解度很大，但在 0.14mol/LNaCl溶液中的溶解度很低；而 RNA核蛋白溶于 0.14mol/LNaCl 溶液。C.用苯酚处理，可使蛋白质变性，且留在苯酚层内；在 DNA溶液中加入2.5倍
12、体积，浓度 为95%的酒精，可将 DNA分离出来。此时 DNA十分黏稠，可用玻璃棒搅成团取出。D.DNA在强酸环境下，水解产生脱氧核糖等小分子物质，它与二苯胺酸性溶液反应，能生 成蓝色化合物。E.实验材料与器械：柠檬酸钠溶液、石英0.14mol/LNaCl溶液、1mol/LNaCl溶液、蒸储水、苯酚、95%酒精、二苯胺试剂、浓硫酸、花椰菜、研钵、烧杯、漏斗、玻璃棒、量筒、石棉 网、酒精灯、吸管、试管等。F.实验步骤：研磨的匀浆 一过滤得滤液滤液稀释6倍离心处理地沉淀物沉淀物再溶解 加苯酚精置后去上清液 提取出DNA DNA鉴定 请阅读以上材料回答下列问题：研磨时，取10g花椰菜，加适量的石英砂
13、和 、将滤液稀释6倍，其目的是 取沉淀物，置于 2ml1mol/LNaCl溶液中，使DNA核蛋白再次溶解，在加 2ml苯酚充分震 荡后静止，待其分层后弃其上层的苯酚。该步骤的目的是除去 。如何将剩余溶液中的 DNA提取出来？如何证明提取物确实是DNA分子5 .下图表示血红蛋白提取和分离实验的部分装置或操作方法，请回答下列问题:0透析袋缓冲液血红蛋白溶液缓冲液 样品样品 甲乙(1)如图甲，表示 过程，该操作目的是去除样品中 的杂质。现有一定量的血红蛋白溶液，进行上述操作时若要尽快达到理想的实验效果，可以 (写出一种方法)。(2)如图乙，往色谱柱中加样的正确操作顺序是 (用序号表示)。在进行 操作
14、前，应该等样品 ,且要 (填“打开”或“关闭”)下端出口。6 .下图为DNA粗提取和鉴定”实验的相关操作。(1)图中实验材料 A可以是 等，研磨前加入的 B应是。(2)通过上述所示步骤得到滤液C后，再向滤液中加入2moL/L的NaCl溶液的目的是,再过滤得到滤液 D,向滤液D中加入蒸储水的目的是 。(3)在“DNA的粗提取和鉴定”实验中，将含有一定杂质的DNA丝状物分别放入体积为2mL的四种溶液中，经搅拌后过滤，获彳4 4种滤液，含DNA最少的是滤液 1B液中搅拌研磨后过滤滤液E22mol/L 的 NaCl 溶液搅拌后过滤滤液F3O. 014mol/L 的 NaCl 溶液中搅拌后过滤滤液G4冷
15、却的95 %的酒精溶液中搅拌后过滤滤液H(4) DN A鉴定的原理是 。7 .测定蛋白质的相对分子质量是研究蛋白质的一项重要技术。常用的测定方法是凝胶色谱 法。请回答下列问题：(1)凝胶色谱法的原理是 。(2)在装填凝胶柱时不得有气泡的原因是 。(3)某人欲使用凝胶色谱法比较 A、B两种蛋白质的分子质量大小，请你选择需要的材料，帮助其设计实验步骤，并预测实验结果，得出相关结论。实验步骤： 实验结果及结论:8 .右图表示血红蛋白提取和分离的部分实验装置，请回答下列问题：(1)血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，其在红细胞中的作用体现了蛋白质具有 功能。(2)甲装置中，B是血红蛋白溶液
16、，则 A是;乙装置中，C溶液的作用是。(3)甲装置用于,目的是。用乙装置分离蛋白质的方法叫 ,是根据 分离蛋白质的有效方法。(4)用乙装置分离血红蛋白时，待 时，用试管收集流出液，每 5mL 收集一管，连续收集。参考答案：1 .(1) DNA 单 AGCATGCGTTCAAGTGCA(3) 185: 4: 5: 4 AACGTAGGGTTACCCTGA解旋酶2 .DNA分子具有双螺旋结构和 DNA分子中碱基的互补配对(2)氢 解旋(3) 3既是原料，又能提供能量碱基互补配对原则(4)温度酸碱度(5)变性、 退火和延伸3 .第一步：出现丝状物的溶液，为溶解着DNA分子的2mol/L的氯化钠溶液。
17、第二步：向其余3支试管中加入伊红一美兰试剂，呈现深紫色的为大肠杆菌超标的自来水。第三步： 将其余2种溶液各取少许倒入 2支试管中，加入双缩月尿试剂，呈现紫色反应的为丙种球蛋白 溶液。最后一瓶为葡萄糖溶液用二苯胺沸水浴变为蓝色；或加入冷却的酒精，搅拌出现丝状物4 .1mol/LNaCl溶液、柠檬酸钠使 DNA核蛋白的溶解度逐渐降低蛋白质向下层DNA溶液中加2.5倍体积，浓度为 95%的酒精，此时用玻璃棒搅动，在玻璃棒上的成团物即是DNA用适量的浓硫酸处理提取物，再滴加二苯胺试剂数滴如有蓝色物质出现既可证明提5. (1)透析(粗分离) 分子量较小(2)完全进入凝胶层6. (1)洋葱(菜花等)洗涤剂
18、和食盐(2)使DNA溶解(于NaCl溶液中)(3)滤液H增加缓冲液的量或及时更换缓冲液关闭使DNA (的溶解度下降而沉淀)析出取物是DNA(4)在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色7. (1)根据相对分子质量的大小分离蛋白质(2)气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，减低分离效果(3)实验步骤：将含有 A、B两种蛋白质的混合液加入装满凝胶的玻璃管上端，用缓冲液进行洗脱，检测它们洗脱的先后顺序(2分)实验结果及结论：若A先于B洗脱出来，则A的相对分子质量大于 B ;若B先于A洗脱出来，则B的相对分子质量大于 A (2分)8. A. (1)运输(2)磷酸缓冲液洗脱血红蛋白(3)透析(粗分离)去
19、除样品中分子量较小的杂质凝胶色谱法相对分子质量的大小(4)红色的蛋白质接近色谱柱底端 点击高考:(09广东A卷38)(1)商品化植酸酶主要来自微生物。在产酶菌株筛选过程中，常在基本培养基中添加不溶 于水的植酸钙制成固体平板，植酸钙被植酸酶分解后可在平板上产生 可根据其大小选择目的菌株，所得菌株需要进一步测定植酸酶活性。活性测定可以植酸钠作为底物，活性可用一定条件下单位时间 表示。(2)利用上述所得菌株制备植酸酶的流程如下图：南体去除透析液(I )去除I中的主要成分为； n中包含多种酸酶等多种蛋白质。请写出一种纯化得到植酸酶的方法及其依据。(3)为建设基因工程菌， 可用PCR等技术从上述菌株中克隆植酸酶基因。 PCR反应包含多 次循环，每次循环包括三步： 。反应过程中打开模板 DNA双链的方法 是。(4)除植酸酶外，微生物还应用在 的生产中。【解析】本题考查对微生物的分离和培养，蛋白质的纯化，酶活性鉴定等知识，结合实际应用。【答案】(1)透明圈植酸钠的消耗量(肌醇和磷酸的生成量)(2)小分子杂质凝胶色谱法：根据蛋白质之间分子大小，吸附性质等差异进行纯化。(或电泳法：根据蛋白质之间电荷，分子大小等差异进行纯化。)(3)变性，复性，和延伸加热(4)蛋白酶，脂肪酶，纤维素酶
