1、PAM (肺泡巨噬细胞) 的制备一、 准备工作1、高压灭菌好的 1PBS 两瓶（1000ml/瓶） 、小托盘 1 个、500ml 烧杯 2 个、大剪刀 1 把、镊子 2 把和 50ml 离心管若干。另需准备好解剖小猪用的手术刀片、棉线等。2、细胞培养液的配备生长液：10%胎牛血清+DMEM 培养基+双抗+两性霉素二、 制备细胞1、将小猪腋下放血致死2、从颈部剖开腹腔，避免伤到气管和肺脏3、用棉线结扎气管上部，然后剪断气管，将气管和肺脏完整取出来，放到准备好的大烧杯中4、转移到细胞培养室，用 PBS 冲洗干净肺脏表面，弃除杂物5、在操作工作台上用灭菌好的剪刀剪断结扎了的气管。 （以下步骤需无菌操
2、作）6、吸取 PBS 灌进肺内，充盈后，用手轻轻捏揉肺叶数次后，把肺内液体倒出到蓝盖瓶中。7、重复灌洗 2 次8、将所收集的液体分装到 50ml 离心管中，42000g、10min 离心9、视情况可以将沉淀细胞再用 PBS 或培养基清洗离心 1 次10、在细胞沉淀中，加入2ml Trizol试剂，用移液器充分吹打、混匀，直到形成清亮不粘稠的液体（表明细胞被充分溶解，基因组DNA被充分打断）。11、 后续可按 Trizol 试剂的标准操作抽提总 RNA。也可以把此 Trizol 试剂保存在冰箱中保存。RNA 抽提第二阶段：分离阶段6加入0. 2 ml 氯仿,剧烈混匀20 s ,室温放置10 mi
3、n 。710 000 rpm/min ,4 离心15 min。第三阶段：RNA的沉淀8吸取上清于5 ml 离心管中,加入0.5mL异丙醇（预冷） 颠倒混匀5 次,室温放置10 min 。(注意：在吸取上清时，切不可将上清与酚交界处的蛋白及下面的酚吸起，造成RNA 的污染)910 000 rpm/min ,4 离心10min。（RNA沉淀在离心后形成胶质片状沉淀附着于试管壁）第四阶段：RNA的漂洗10去上清,沉淀用1ml 75 %乙醇漂洗，振荡，7 000 rpm/min ,4 离心10 min，倒净乙醇。11RNA 沉淀加入0.5 ml无水乙醇 漂洗，振荡，7 000 rpm/min ,4 离
4、心5 min，倒净无水乙醇。（缩短RNA沉淀晾干的时间，避免RNA 在空气中暴露时间过长而增加外源性Rnase对RNA的降解）第五阶段：RNA的再溶解12在超净工作台上平放离心管,待离心管管壁无明显液滴时加入50 l DEPC 处理的灭菌双蒸水，在55-60 0C温育10min，溶解RNA 沉淀。 13将溶解充分的RNA溶液转移到1.5ml离心管中，做好标签，放入-80 0C的冰箱中保存备用。总 RNA 检测及浓度测定总 RNA 的完整性可通过普通琼脂糖凝胶电泳检测，过程如下：1. 制备 1.2琼脂糖凝胶：将 1.2g 琼脂糖溶于 1TAE 中，稍加冷却，加入少许 EB，混合均匀后，灌制凝胶，
5、待凝胶凝固好后，即可使用。2. 点样：取 2L 总 RNA 与 2L Gel Loading Buffer 及 6L DEPC 水混合后点于点样孔中，15V/cm，电泳 20min。3. 拍照：电泳结束后，用紫外透射仪观察，并用凝胶成像系统成像。4. 用紫外分光光度计测量总 RNA 样品浓度，每个 3 次，取平均值。5. 根据所测浓度，用 DEPC 水稀释每个 RNA 样品浓度至 1g/L，其余样品保存在超低温冰箱备用。总 RNA 反转录根据TIANGEN TIANScript RT Kit cDNA 第一链合成试剂盒，其操作步骤如下：1) 在冰浴的无核酸酶的离心管中加入如下反应混合物：15g总RNA， 2L oligo(dT)15 , 2LdNTP(2.5mM each),补RNase-free ddH 2O定容至13.5 L。2) 70加热5分钟后迅速在冰上冷却 2分钟，简短离心收集反应液后加入一下各组分：4L 5First-Strand Buffer,1L 0.1 M DTT,0.5L RNasin.3) 加1L （200U ）TIANScript M-MLV,轻轻用移液器混匀。4）42温浴 50分钟。5）95加热 5 分钟终止反应，以看家基因（ GAPDH）引物扩增，验证反转录是否成功，将反转录产物置于-20保存备用。
