第二章 微生物的分类鉴定.ppt

1、第二章 微生物的分类鉴定与常见种类,一、微生物分类鉴定,步骤： 获得该微生物的纯种培养物 测定一系列必要的鉴定指标 查找权威性的鉴定手册 不同种类微生物应采用不同的重点鉴定指标： 真菌：形态特征较丰富、细胞体积较大，以形态特征为主要指标 放线菌、酵母菌：形态特征与生理特征兼用 细菌：形态特征较缺乏，使用较多的生理、生化和遗传等指标,鉴于微生物形体微小、结构较简单等特点，微生物分类和鉴定除了像高等生物那样，采用传统的形态学、生理学和生态学特征之外，还必须寻找新的特征作为分类鉴定的依据。 1.1 经典分类鉴定依据 1.1.1 微生物的形态特征 形态学特征始终被用作微生物分类和鉴定的重要依据之一，其

2、中有两个重要原因：一是它易于观察和比较，尤其是在真核微生物和具有特殊形态结构的细菌中；二是许多形态学特征依赖于多基因的表达，具有相对的稳定性。 培养特征 a. 固体培养特征：菌落特征，大小、侧面隆起、光泽、粘稠、颜色、边缘、表面状况、质地、水溶性色素（粘质沙雷氏菌产红色或紫红色色素）等 b. 半固体培养特征：明胶液化、鞭毛运动情况 c. 液体培养特征：表面菌膜、混浊，底部沉淀,各种微生物形成的菌落特征,固体培养基,液体培养基,半固体培养基,细胞形态 形态：球形、杆状、弧形、螺旋形、丝状、分枝及特殊形状 大小：其中最重要的是细胞的宽度或直径 排列：单个、成对、成链或其他特殊排列方式 特殊细胞结构

3、 有无鞭毛、芽孢、荚膜（糖被）、菌胶团 孢子：形状、大小、颜色、着生位置、数量及排列 细胞附属物：如柄、丝状物、鞘、异形胞等 超微结构：壁、内膜系统、放线菌孢子表面特征等 细胞内合物硫粒、异染颗粒、伴孢晶体、PHB、气泡等,染色反应 革兰氏染色、抗酸性染色 抗酸性染色：分枝杆菌属或诺卡氏菌属的一些菌，普通方法染不上色，须加温或长时间染色，染色后的细胞用酸或碱处理不能脱色，把具此性质的细菌称为抗酸性细菌（含分枝菌酸，能与石炭酸和复红形成的复合物牢固结合，并能抵抗酸性酒精的脱色）。 运动性 鞭毛泳动、滑行、螺旋体运动方式,1.1.2 微生物的生理生化特性 生理生化特征与微生物的酶和调节蛋白质的本质

4、和活性直接相关，酶及蛋白质都是基因产物，所以，对微生物生理生化特征的比较也是对微生物基因组的间接比较，加上测定生理生化 特征比直接分析基因组要容易得多，因此生理生化特征对于微生物的系统分类仍然是有意义的。 在以实用为主要目的表型分类中，大量原核生物的属和种，仅仅根据形态学特征是难以区分和鉴别的，所以生理生化特征往往是这些医学上或其他应用领域中重要细菌分类鉴定的主要特征。,（1）营养类型 光能无机自养型（光能自养型） 光能有机异养型（光能异养型） 化能无机自养型（化能自养型） 化能有机异养型（化能异养型） （2）对碳源的利用 对各种单糖、双糖、多糖以及醇类、有机酸等的利用 （3）对氮源的利用 对

5、蛋白质、蛋白胨、氨基酸、含氮无机盐、N2等的利 用 （4）对生长因子的需要 对特殊维生素、氨基酸等的依赖性 乳酸菌对生长因子的要求较高,（5）对氧的要求好氧、微好氧、厌氧及兼性厌氧 （6）对温度的适应性最低温、最适温、最高温、产物积累温度、致死温度 （7）对PH的适应性 在一定PH条件下的生长能力及生长的PH范围 生长的PH范围：肠道细菌较宽；血液寄生微生物较窄，因循环系统PH一般稳定在7.3,（8）对渗透压的适应性 对盐浓度的耐受性或嗜盐性 （9）对抗生素及抑菌剂的敏感性 对抗生素、氰化钾(钠)、胆汁、石炭酸（系数）或某些染料的敏感性 （10）代谢产物 各种特征性代射产物 如色素、有机酸、产

6、气、硫代氢、明胶液化作用 大肠菌群乳糖发酵，产酸、产气,1.1.3 微生物的生态特性 在自然界的分布情况 与宿主关系：共生、寄生、致病性等 宿主种类 有性生殖情况 生活史，等,1.1.4 血清学试验与噬菌体分型 （1）血清学试验 细菌细胞和病毒等都含有蛋白质、脂蛋白、脂多糖等具有抗原性的物质，不同微生物抗原物质结构不同，赋予它们不同的抗原特征。常借助特异性的血清学反应来确定未知菌种、亚种或菌株。 由于某些传染病与特定的血清型密切相关，其分布也有一定的区域性特征，所以血清型的划分在流行病的研究中有重要意义。 通常是对全细胞或者细胞壁、鞭毛、荚膜或粘液层的抗原性进行分析比较。 虽然血清学试验被广泛

7、用于微生物分类鉴定的研究，但比较成功的应用是对种内（以及个别属内）不同菌株血清型的划分。 例如，根据鞭毛抗原(H抗原)苏云金芽孢杆菌分成40多个血清型 根据荚膜抗原肺炎链球菌分成近百个血清型 根据菌体(O)抗原、H抗原和表面(Vi)抗原将沙门氏菌属细菌分成约2000个血清型 大肠杆菌O-157,（2）噬菌体分型 在原核生物中已普遍发现有相应种类的噬菌体。噬菌体对宿主的感染和裂解作用常具有高度的特异性，即一种噬菌体往往只能感染和裂解某种细菌，甚至只裂解种内的某些菌株。所以，根据噬菌体的宿主范围可将细菌分为不同的噬菌型和利用噬菌体裂解作用的特异性进行细菌鉴定。 这对于追溯传染病来源、流行病调查以及

8、病原菌的检测鉴定有重要意义。 例如，鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)噬菌体已被用于对该菌的快速鉴定。 在金黄色葡萄球菌引起的流行病的调查中，噬菌体分型也发挥了作用。 此外，在工业生产中，噬菌体分型对防止噬菌体危害也有指导意义。,1.2 现代分类鉴定依据,1.2.1 细胞化学成分分析鉴定法 根据不同细菌和放线菌细胞壁的肽聚糖分子结构和成分的差异，采用细胞壁成分分析法,对菌种分类鉴定有一定的作用 放线菌全细胞水解液可分四类主要糖型,故采用全细胞水解液糖型分析法可进行初步分类鉴定 位于细菌、放线菌细胞膜上的磷酸类脂成分,在不同属中有所不同,可用于分类鉴别； 诺卡氏菌形放线菌所含枝菌酸

9、的碳链长度有明显差别,故对枝菌酸的分析可用于属的分类。 此外，气相色谱技术可分析微生物细胞和代谢产物中的脂肪酸类和醇类等成分,对厌氧菌等的鉴定很有用。,1.2.2 核酸的碱基组成和分子杂交,与形态及生理生化特性的比较不同，对DNA的碱基组成的比较和进行核酸分子杂交是直接比较不同微生物之间基因组的差异，因此结果更加可信。 比较DNA的碱基组成和进行核酸分子杂交，是目前通过直接比较基因组进行生物分类最常用的两种方法。,（1） DNA的碱基组成(G+C)mol% DNA的碱基组成和排列顺序决定生物的遗传性状，所以DNA碱基组成是各种生物一个稳定的特征。分类学上，用G+C占全部碱基的摩尔百分比值（简称

10、“GC比”）来表示各类生物的DNA碱基组成特征。 亲缘关系近的生物，它们应该具有相似的GC比；若不同生物之间GC比差别大表明它们关系远。 但具有相似GC比的生物并不一定表明它们之间具有近的亲缘关系，因为核苷酸序列可差别很大 高等植物的GC比范围大约为35-50%； 脊椎动物GC比约为3545%之间； 而原核生物中GC比变化幅度宽达2280%，这也足以表明原核生物是一个极为多样性的类群。,同一个种内的不同菌株GC比差别应在45%以下 （差别 5% 肯定不是同一个种） (2%无意义，因测定方法本身的误差可能高达2%) 同属不同种的差别应低于1015%，通常低于10% （差别 15% 肯定不是同一个

11、属） 是发表任何微生物新种时必须具有的重要指标在疑难菌株鉴定、新种命名、建立一个新的分类单位时，G+C含量是一项重要的、必不可少的鉴定指标。其分类学意义主要是作为建立新分类单元的一项基本特征和把那些GC比差别大的种类排除出某一分类单元。,测定DNA碱基组成的方法：由于热变性温度法操作简单、重复性好而最为常用。 基本原理：将DNA加热，两条单链逐渐被打开，从而使DNA溶液260nm紫外吸收明显增加，称DNA的增色效应。G+C增加，所需温度也较高，当温度高达一定值时，DNA完全分离成单链，此后紫外吸收不再增加。 DNA的热变性过程(即增色效应的出现)是在一个狭窄的温度范围内发生的，紫外吸收增加的中

12、点值所对应的温度称为该DNA的热变性温度(Tm)。在一定条件下，DNA的Tm值与DNA的G+Cmol%成正比。 Tm69.30.41（G+Cmol）,（2）核酸的分子杂交 DNA-DNA杂交 基本原理：双链DNA分子加热可变性，冷却处理时，又可复性。不仅同一菌株的DNA单链可以复性结合成双链，来自不同菌株的DNA单链，只要二者具有同源互补的碱基序列，它们也会在同源序列之间互补结合形成双链，这就称之为DNA-DNA分子杂交。不同微生物之间，DNA同源程度越高，其杂交率就越高，若两个菌株DNA分子序列完全相同，则应100%地杂交结合。 具体测定方法很多，按杂交反应的环境可分为液相杂交和固相杂交两大

13、类。在这些方法中，有的需要用同位素标记DNA，有的则用非同位素标记，而“复性速率法“则是通过测定单链DNA分子复性结合的速率来计算DNA的同源性而不需要对DNA分子进行标记。,细菌常用固相杂交法：,（参照菌株）A菌 B菌（待测） DNA DNA （ 同位素标记、酶切并解链）单链 单链（固定于滤膜上，未标记） 最适温度复性杂交洗涤测定放射强度杂交率（以参照菌株自身复性的放射性值为百分之百 ）60%同一个种；70%同一亚种；2060%同属不同种 对于许多有争议的种的界定和建立新种起了重要作用, DNA-rRNA杂交 rRNA是DNA转录的产物，在生物进化过程中，其碱基序列的变化比基因组要慢得多，保

14、守得多，它甚至保留了古老祖先的一些碱基序列。因此，当两个菌株的DNA-DNA杂交率很低或不能杂交时，用DNA-rRNA杂交仍可能出现较高的杂交率，因而可以用来进一步比较关系更远的菌株之间的关系，进行属和属以上等级分类单元的分类。 DNA-DNA杂交和DNA-rRNA杂交的原理和方法基本相同，只是在技术细节上有些差异，如DNA-rRNA杂交中，用同位素标记的是rRNA而不是DNA等等。, 核酸探针 广泛用于微生物鉴定、传染病诊断、流行病调查、食品卫生微生物检测以及分子生物学许多领域。 所谓核酸探针(probe)是指能识别特异核苷酸序列的、带标记的一段单链DNA或RNA分子。因此，一种核苷酸片断能

15、否作为探针用于微生物鉴定，最根本的条件是它的特异性，即它能与所检测的微生物的核酸杂交而不能与其他微生物的核酸杂交。 根据特异性的不同，在微生物鉴定与检测中的作用也不同，有的探针只用于某一菌型的检测，有的可能用于某一种、属、科甚至更大类群范围的微生物的检测或鉴定。例如，从一株淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)隐蔽性质粒制备的DNA探针，它具有种的特异性，可用来检测和鉴定这种引起人类性行为传播疾病的细菌。,使用核酸探针来鉴定或检测微生物的方法，是将探针与所检测的细菌进行杂交。在细菌鉴定或检测临床标本中的细菌时，常用菌落原位杂交法，大致步骤是：将细菌点种于硝酸纤维素膜上进行培

16、养；加溶菌剂使细胞释放出DNA分子；加变性剂使DNA离解成单链并固定于膜上；加入带标记的核酸探针进行杂交；洗膜后进行显色或显影鉴定。 用核酸探针来鉴定或检测微生物，具有准确、快速等优点，特别是当用常规方法难于鉴定和检测时，往往更显示其优越性。,1.2.3 微生物全基因组序列,DNA是除少数RNA病毒以外的一切微生物的遗传信息载体。 每一种微生物都有其自身独特而稳定的基因组DNA序列，不同菌种间基因组序列的差异程度，代表着它们之间亲缘关系的疏密。 对那些与人类健康、生活和生产关系重大的微生物，进行全基因组DNA序列测定，是当前生物科学领域中掌握某微生物全部遗传信息的最佳途径，也是微生物现代分类鉴

17、定中更细致和更精确的遗传性状指标。,1.2.4 遗传重组,大多数真核生物都能进行有性生殖，所以分类学上用能否进行有性生殖来定义物种。 原核生物中，虽然没有有性生殖，但它们可以通过转化、转导和接合作用进行染色体基因的交换，这种交换通常具有种属特异性。 研究表明：发生接合、转化和普遍性转导的细菌之间需要存在广泛的染色体同源性，否则此类重组(同源重组)即不能发生。因此，在细菌分类中，发生同源重组可以作为细菌密切相关的证据。例如，转化通常只在同属内的不同种之间发生，很少在属间出现。 值得注意的是：由于同源重组还涉及其他因素，当细菌之间不能发生重组时，不一定是由于DNA序列不同源，而有可能是由于其他因素

18、所致。因此，不能以同源重组作为唯一的判断标准。,1.2.5 氨基酸顺序和蛋白质分析,蛋白质是基因的产物，蛋白质的氨基酸顺序直接反映mRNA顺序而与编码基因密切相关。因此，可以通过对某些同源蛋白质氨基酸序列的比较来分析不同生物系统发育关系，序列相似性越高，其亲缘关系愈近。由此可以根据蛋白质的氨基酸序列资料构建系统发育树和进行分类。 一般来说，蛋白质氨基酸顺序的进化速率大体上是恒定的，但功能不同的蛋白质常以不同的速率进化。功能重要的分子序列或序列区域往往进化变化速率低。但也有资料表明，某些蛋白质分子其功能并非严格不变，进化变化速率也不恒定。所以，在研究中必须根据所比较的类群注意选择适当的分子。一般

19、来说，细胞色素和其他电子传递蛋白、组蛋白、热休克蛋白、转录和翻译的蛋白以及许多代谢酶的序列都可以用于微生物的分类研究。,蛋白质的氨基酸顺序测定总的说还是很烦杂耗费 间接的比较方法：电泳图谱比较 电泳图谱比较进行分类或鉴定的前提是：亲缘关系相近的微生物应具有相似的蛋白质，反之亦然；当把一个菌株所产生的系列蛋白质在标准条件下电泳，就会产生特征性的电泳区带组成的电泳图谱(或称蛋白质“指纹”图)，亲缘关系相近的菌株，它们的指纹也应相似。 在细菌分类鉴定研究中，常采用可溶性蛋白或全细胞蛋白提取液进行电泳图谱比较，或者比较同功酶的电泳迁移率。 从目前资料看，蛋白质电泳图谱可以作为种和种以下分类和鉴定的一个

20、指纹。对于属以上分类单元的分类或鉴定效果较差。,1.2.6 数值分类鉴定法,所谓数值分类法，是通过广泛比较分类单位的性状特征（形态、 生理、生化、遗传、生态和免疫学等），然后计算它们之间的相似性，再根据相似性的数值划分类群的一种分类方法。 数值分类法的分类原则不同于传统的分类法，其中最重要的区别在于：传统分类法的分类特征有主次之分，而数值分类法则强调所采用的分类特征同等重要，在划分类群时它们都具有同等的地位。,数值分类可大致分为五个步骤： 确定分类单位和选择分类特征。数值分类最低等级的分类单位称操作分类单位(简称OTU)，OTU可以是菌株，也可以是种或属等。OTU确定后即选择分类特征，数值分类

21、要求特征函盖面广，项目数50个以上甚至几百个； 进行特征测定或从文献中收集有关OTU的各项特征的资料； 根据所编制的计算机程序要求，将特征资料进行编码、标准化并输入计算机； 由计算机计算各OTU之间的相似性（相关系数）并根据相似性的数值进行聚类分析、分群归类； 输出分类结果。,数值分类法是根据大量生物表型特征的总相似性进行分类，所以其分类结构所表示的是一种表型关系，并不直接反映系统发育的自然规律，因此数值分类所划分的类群又称为表元(phenon)或表观群(phemotic group)以区别于传统的分类单元。 但通过对数值分类结构的分析，可以把其分类结果作为建立或修改传统(自然)分类单元(如种

22、、属等)的依据。数值分类使生物分类从传统分类的定性描述发展到进行定量分析的水平，其主要目的是建立一种客观的聚类方法，并实现聚类过程的自动化。 计算相关系数,1.3微生物的微量、简便、快速或自动化鉴定技术,如何使微生物鉴定技术快速、准确、简易和自动化，一直是微生物学工作者研究的热点。 这方面已取得了突破性进展，许多方法技术，在微生物鉴定中广为使用。 国外的产品已标准化、系统化和商品化，主要有法国生物-梅里埃集团的API/ATB；瑞士罗氏公司的Micro-ID，Enterotube，Minitek；美国的Biolog全自动和手动细菌鉴定系统；日本的微孔滤膜块等。其中API/ATB包括众多的鉴定系统

23、，共计有750种反应，可鉴定几乎所有常见的细菌。 微量多项鉴测技术优点突出，不仅能快速、敏感、准确、重复性好地鉴检微生物，而且简易，节省人力、物力、时间和空间， 缺点是各系统差异较大，有的价格贵，有的个别反应不准，难判定，但毫无疑问，它是微生物技术方法向快速、简易和自动化发展的重要方向之一。,API20E系统是API/ATB中最早和最重要的产品，也是国际上应用最多的系统。该系统的鉴定卡是一块有20个分隔室的塑料条，分隔室由相连通的小管和小杯组成，各小管中含不同的脱水培养基、试剂，或底物等，每一分隔室可进行一种生化反应，个别的分隔室可进行两种反应，主要用来鉴定肠杆菌科细菌，如图12-4所示。,鉴

24、定未知细菌的主要过程：将菌液加入每一个分隔室 培养后，有的分隔室的小杯中需要添加试剂，观察鉴定卡上20个分隔室中的反应变色情况，根据反应判定表，判定各项反应是阳性还是阴性反应 按鉴定卡上反应项目从左到右的顺序，每三个反应项目编为一组，共编为七组，每组中每个反应项目定为一个数值，依次是1、2、4，各组中试验结果判定的反应是阳性者记“”，则写下其所定的数值，反应阴性者记“”，则写为0，每组中的数值相加，便是该组的编码数，这样便形成了7位数字的编码，表12-10为举例说明 用7位数字的编码查API20E系统的检索表，或输入计算机检索，则能将检验的细菌鉴定出是什么菌种或生物型。,表12-10 API2

25、0E举例说明,另一种应用广泛的是Enterotube系统，可以称为肠道管系统。它的鉴定卡是由带有12个分隔室的一根塑料管组成，每个分隔室内装有不同的培养基琼脂斜面，能检验微生物的15种生理生化反应，一根接种丝穿过全部分隔室的各种培养基，并在塑料管的两端突出，被两个塑料帽盖着，像一根火腿肠，如图12-5所示。,鉴定未知菌时，将塑料管的两端帽子移去，用接种丝一端的突出尖端接触平板上待鉴定的菌落中心，然后在另一端拉出接种丝，通过全部分隔室，使所有培养基都被接种，再将一段接种丝插回到4个分隔室的培养基中，以保持其还原或厌氧条件。图12-6示意肠道管系统的接种过程。,培养后，有的分隔室也需加试剂。然后按

26、API20E类似的步骤，观察反应变色情况，判定试验结果阴性或阳性，写出编码数，形成5位数的编码，因12个分隔中有3个分隔中的培养基都能观察到2种生化反应，此肠道管系统共15个反应，可分为5个组。 根据编码查肠道管系统的索引，或用计算机检索，获得鉴定细菌的种名或生物型。,Biolog微生物自动分析系统是美国Biolog公司研制开发的新型自动化快速微生物鉴定系统，以微生物对微平板上95种碳源（96孔的细菌培养板）的利用情况为基础从而进行微生物鉴定。 独特的原理-代谢指纹法：碳源（或氮源）利用实验原理。不同细菌会利用不同种类的碳源（或氮源）进行新陈代谢，将每种细菌能利用和不能利用的一系列碳源（或氮源

27、）进行排列组合，就构成了该种细菌特定的代谢指纹。在反应体系中加入指示剂（ TTC，无色的氧化型转变为紫色的还原型），根据反应的阴阳性得到某一细菌的反应图谱。检测时，将待检菌的反应结果与数据库中的代谢图谱进行对照，从而得到该细菌的检测结果。,鉴定菌种数量： 2000种 鉴定菌种范围：包括肠杆菌、弧菌、嗜血杆菌、奈瑟菌、葡萄球菌、链球菌、芽孢杆菌、棒状杆菌、厌氧菌、酵母样真菌、丝状真菌等 仪器读数方法：比色 生化反应数量：95个生化反应,有一种可携带的检测水中大肠杆菌数的大肠杆菌测试卡，即微孔(Milliporo)滤膜菌落计数板(图12-7)。 它是在一块拇指大小的塑料板上，装有一薄层脱水干燥的大

28、肠杆菌选择鉴定培养基，其上覆盖微孔滤膜(0.45m)，整个塑料板有一外套。,检测时，脱下外套，将塑料板浸入受检水中约半分钟，滤膜仅允许1毫升水进入有培养基的一边，干燥的培养基则吸水溶解，扩散与滤膜相连，而1毫升水中的大肠杆菌则滞留在膜的另一边，再将外套套上，培养12-24小时， 统计滤膜上形成的兰或绿色菌落数。菌落的多少可以表明水中污染大肠菌群的状况。 该测定卡携带和培养都方便，适于野外工作和家庭使用，因可以放在人体内衣口袋中培养。 置换塑料板上的培养基，可以制成检测各种样品的微孔滤膜块。,2.细菌的分类,2.1 细菌分类的依据 2.1.1 形态特征 形态、排列、革兰氏染色、鞭毛、芽孢、荚膜、

29、内含物 2.1.2 培养特征 琼脂平皿培养特征（菌落大小、颜色、透明度、粘稠度；边缘、表面、隆起） 明胶穿刺培养特征（是否液化，是否产生明胶酶） 液体培养特征（是否有菌膜、混浊、沉淀） 2.1.3 生理特征及生化反应 （1）发育的温度、需氧程度、最适PH、致病性、产毒素 （2）营养源：碳源（单糖、双糖、糖醇、脂肪酸、有机酸、醇、CO2等）、氮源（蛋白质、蛋白胨、氨基酸、铵盐、硝酸盐、N2）、能源,细菌在半固体培养基中的生长现象,有动力现象,无动力 现象,聚-羟基丁酸 Polyhydroxybutyric acid (PHB),硫粒sulfur globules,异染颗粒 metachromat

30、ic granule贮藏磷元素和能量,气泡 Gas vacuoles,Left: 单菌染色结果(G+或 G-),Right: 混合菌染色结果(G+和 G-),细菌细胞结构,革兰氏染色结果及细菌分类,革兰氏染色阴性,矮小芽孢杆菌,在液体培养基上:1.多数细菌呈现均匀浑浊（表现均匀生长）。2.部分形成菌膜(专性需氧菌），在液体培养基表面上形成菌膜，液体透明或者稍浑浊。3.形成菌环，在液体中间形成一圈环状物形成沉淀。4.在液体底部形成沉淀。,（3）代谢特征 a.糖发酵试验 不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异，或能利用或不能利用，能利用者，或产气或不产气。可用指示剂（溴甲酚紫）及发酵管检验。 观察

31、培养基颜色有无改变（产酸），小倒管中有无气泡，微小气泡亦为产气阳性；若为半固体培养基，则检视沿穿刺线和管壁及管底有无微小气泡，有时还可看出接种菌有无动力，若有动力、培养物可呈弥散生长。 本试验主要是检查细菌对各种糖、醇和糖苷等的发酵能力，从而进行各种细菌的鉴别 。如大肠菌群：发酵乳糖,糖发酵试验结果判断,糖发酵试验,糖发酵试验,葡萄糖的氧化发酵试验,细菌对糖类的利用有2种类型：1种是从糖类发酵产酸，不需要以分子氧作为最终受氢体，称发酵型产酸；另一种则以分子氧作为最终受氢体，称氧化型产酸。前者包括的菌种类型为多数。 氧化型产酸量较少，所产生的酸常常被培养基中的蛋白胨分解时所产生的胺所中和，而不表

32、现产酸。为此，Hugh和Leifson提出一种含有低有机氮的培养基，用以鉴定细菌从糖类产酸是属氧化型产酸或发酵型产酸。 这一试验广泛用于细菌鉴定。一般用葡萄糖作为糖类代表。也可利用这一基础培养基来测定细菌从其他糖类或醇类产酸的能力。,穿刺接种在上述培养基中。用油封盖（凡士林：液体石蜡1：1混合后灭菌），约加0.51厘米厚，以隔绝空气为闭管，不封油为开管，同时还要有不接种的闭管作对照。适温培养，观察结果。 结果观察： 氧化型产酸仅开管产酸，氧化作用弱的菌株往往先在上部产碱（12d），后来才稍变酸。 发酵型产酸则开管及闭管均产酸，如产气，则在琼脂柱内产生气泡。,b. 甲基红试验（methyl re

33、d test） 肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸、琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红。大肠杆菌 + 产气杆菌 应用：是肠道杆菌常用的生化反应试验，主要用于区别大肠肝菌和产气肠杆菌,c. V-P试验(V-P test)葡萄糖 丙酮酸 丙酮酸缩合脱羧 乙酰甲基甲醇 强碱环境下，被空气中氧氧化 二乙酰 与蛋白胨中的精氨酸的胍基作用 红色化合物（+ 产气杆菌）无色化合物（- 大肠杆菌） 测定某些细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产物的能力，如丙酮酸。 应用：是肠道杆菌常用的

34、生化反应试验，主要用于区别大肠肝菌和产气肠杆菌,葡萄糖发酵形成丙酮酸后的不同代谢途径,葡萄糖,丙酮酸,大量混合酸,pH降至4.4以下,甲基红试剂,培养基变红,乙酰甲基甲醇,二乙酰,V-P试剂,培养基变红,脱羧,d. 吲哚试验( indol test) 细菌产生色氨酸酶，可分解蛋白胨中的色氨酸，生成靛基质（吲哚），靛基质与试剂对二甲基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰靛基质。色氨酸 吲哚（无色）对二甲基氨基苯甲醛 玫瑰吲哚（红色，+ 大肠杆菌）不产吲哚（无色，- 产气杆菌） 试验方法：取培养24h培养液，先加入少量乙醚，摇动试管以提取和浓缩吲哚，待其浮于培养液表面后，再沿试管壁徐缓加入吲哚试剂数滴，在接触

35、面呈红色，即为阳性。 应用：用于肠道杆菌的鉴定,Indol test 吲哚试验tryptophan色氨酸indole吲哚玫瑰吲哚 Kovacs reagent吲哚试剂（对二甲基氨基苯甲醛）,- +,E.coli,蛋白胨水试管,枸橼酸盐利用试验(citrate test),某些细菌能利用培养基中的枸橼酸盐作为碳源，细菌生长过程中分解枸橼酸盐及分解培养基中的铵盐后，使培养基变碱，使指示剂呈碱性反应。 培养基：枸橼酸盐培养基 试剂：溴麝香草酚蓝（pH6.0以下呈黄色，pH7.6以上呈蓝色） 结果：培养基变蓝： +培养基不变色： 应用：肠杆菌科属间鉴别,e.硫化氢（H2S）试验有些细菌可分解培养基中含

36、硫氨基酸或含硫化合物，而产生硫化氢气体，硫化氢遇铅盐或低铁盐可生成黑色沉淀物。含硫氨基酸 H2S醋酸铅黑色沉淀 （+ 产气杆菌）无黑色沉淀（- 大肠杆菌） 应用：常用于肠道杆菌的鉴定,苯丙氨酸脱氨实验,原理：有的细菌具有苯丙氨酸脱氨酶，可使培养基中的苯丙氨酸脱氨，形成苯丙酮酸，后者与三氯化铁作用，形成绿色化合物。 培养基：苯丙氨酸琼脂 试剂：10三氯化铁 结果：加入试剂后培养基呈现绿色为阳性 应用：多用于肠道杆菌的鉴定,氨基酸脱羧酶的测定,有些细菌含有氨基酸脱羧酶，使羧基释出，生成胺类和二氧化碳。此反应在偏酸的条件下进行。当培养基含胺类时呈碱性反应，使指示剂变色。 接种与观察结果：用幼龄培养液

37、作为菌种，直接接种。接种后封油，对照管与测定管同时接种封油。肠肝菌科的细菌于37培养4天观察。 当指示剂（溴甲酚紫）呈紫色或带红色调的紫色者为阳性，呈黄色者为阴性。对照管应呈黄色反应。,丙二酸盐利用试验,丙二酸盐是三羧酸循环中琥珀酸脱氢酶的抑制剂。能否利用丙二酸盐，也是细菌鉴定中的一个鉴别性特征。 许多微生物代谢有三羧酸循环，而琥珀酸脱氢是三羧酸循环的一个环节，丙二酸与琥珀酸竞争琥珀酸脱氢酶，如丙二酸不被分解，则琥珀酸脱氢酶被占据，不能释放出来催化琥珀酸脱氢反应，抑制了三羧酸循环。 接种和观察结果： 用幼龄菌种接种测定培养基和空白培养基，于适温培养12d，观察培养基变色情况。 如测定培养基生长

38、并变蓝色（溴麝香草酚蓝，pH6.0以下呈黄色，pH7.6以上呈蓝色） ，表示可利用丙二酸盐，为阳性结果。反之，如测定培养基未变色，而空白对照培养基生长，则为阴性，即不利用丙二酸盐。,f.硝酸盐还原试验（硝酸盐还原酶）硝酸盐 亚硝酸盐氨、氮（彻底还原） 无色红色（阳性）无色 （继续如下实验） 锌（催化剂）硝酸盐 加热 亚硝酸盐 亚硝酸盐试液 红色（不能利用，阴性）仍无色（说明硝酸盐被彻底还原，阳性）亚硝酸试剂 A液：对氨基苯磺酸（磺胺酸冰醋酸溶液） B液： -萘胺（萘胺乙醇溶液）,临试前将试剂的A和B试液各0.2ml等量混合，取混合试剂约0.1ml，加于液体培养物或琼脂斜面培养物表面，观察颜色变

39、化。 某些细菌能够把培养基中的硝酸盐还原为亚硝酸盐；亚硝酸盐与乙酸反应生成亚硝酸；亚硝酸与对氨基苯磺酸作用，形成对重氮苯磺酸；对重氮苯磺酸与-萘胺结合，形成红色的-萘胺偶氮苯磺酸,g.石蕊牛奶的反应,牛奶中主要含有乳糖和酪蛋白，在牛奶中加入石蕊是作为酸碱指示剂和氧化还原指示剂。石蕊在中性时呈淡紫色，酸性时呈粉红色，碱性呈蓝色，还原时则自上而下地褪色变白。细菌对牛奶的作用有以下几种： 酸凝固细菌发酵乳糖产生乳酸，使石蕊变红，当酸度很高时，可使牛奶凝固。 凝乳酶凝固有些细菌能产生凝乳酶，使牛奶中的酪蛋白凝固，在中性环境发生。通常这种菌还具有酪蛋白水解酶，能分解酪蛋白产生碱性物质，使石蕊变蓝。 胨化

40、细菌产生蛋白酶，使酪蛋白分解，故牛奶变得比较澄清。胨化作用可以在酸性或碱性条件下进行。 还原细菌生长旺盛，使培养基氧化还原电位降低，因此石蕊还原褪色。接种与观察结果：接种待测菌株，适温培养23d，按上述特征观察和记录牛奶产酸、产碱、凝固或胨化等反应。7d后仍无变化为阴性反应。,H.三糖铁（TSI）琼脂试验,试验方法：以接种针挑取待试菌可疑菌落或纯培养物，穿刺接种并涂布于斜面，置361培养1824h，观察结果。 培养基：乳糖：蔗糖：葡萄糖=10：10：1；加有酚红 本试验可同时观察糖发酵产酸或产酸产气（变黄）；产生硫化氢（变黑）。 只能利用葡萄糖的细菌，葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，

41、生成的少量酸，因接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面后来又变红，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，所以仍保持黄色。,I.硫化氢-靛基质-动力（SIM）琼脂试验,试验方法：以接种针穿刺接种约1/2深度，置361培养1824h，观察结果。培养物呈现黑色为硫化氢阳性，混浊或沿穿刺线向外生长为有动力，然后加吲哚试剂数滴于培养表面，静置10min，若试剂呈红色为吲哚阳性。培养基未接种的下部，可作为对照。 本试验用于肠杆菌科细菌初步生化筛选，与三糖铁琼脂等联合使用可显著提高筛选功效。,2.1.4 微生物酶的测定,a. 氧化酶（细胞色素氧化酶） 氧化酶亦即细胞色素氧化酶，

42、为细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶，氧化酶先使细胞色素C氧化，然后此氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化，产生颜色反应。 试验方法：在琼脂斜面培养物上或血琼脂平板菌落上滴加试剂12滴，阳性者Kovacs氏试剂（盐酸二甲基对苯二胺 ）呈粉红色深紫色；阴性者无颜色改变。应在数分钟内判定试验结果。,b.过氧化氢酶的测定 过氧化氢酶又称接触酶，能催化过氧化氢分解成水和氧。 H2O2H2O+O2 枯草芽孢杆菌 + 产氮芽孢杆菌 - 试验方法：取一干净的载波片，在上面滴1滴310的H2O2，挑取1环培养1824h的菌苔，在H2O2溶液中涂抹，若有气泡（氧气）出现，则为过氧化氢酶阳性，无气泡者为阴性。 也可将过氧

43、化氢溶液直接加入斜面上，观察气泡的产生。,c.尿素酶（Urease，脲酶）试验 有些细菌能产生尿素酶，将尿素分解、产生2个分子的氨，使培养基变为碱性，酚红呈粉红色。尿素酶不是诱导酶，因为不论底物尿素是否存在，细菌均能合成此酶。其活性最适pH为7.0。酚红： 黄色 红色（+ 普通变形杆菌）黄色（- 大肠杆菌） 试验方法：挑取1824h待试菌培养物大量接种于液体培养基管中，摇均，于361培养，观察结果。或涂布并穿刺接种于琼脂斜面，不要到达底部，留底部作变色对照。培养24h左右，观察结果，如阴性应继续培养至4天，作最终判定，变为粉红色为阳性。,Urease Test尿素酶试验：,urea尿素,amm

44、onia氨,D.-半乳糖苷酶（ONPG）的测定,本试验应用于肠肝菌科的鉴定 由于-半乳糖苷酶催化水解-半乳糖苷化合物中的-D-半乳糖苷键，ONPG（邻硝基苯酚-D-吡喃半乳糖苷）是一种常用的色素原基质，在-半乳糖苷酶存在下，此无色的ONPG复合物会分解成半乳糖和邻硝基酚（ONP），邻硝基酚是黄色的。 测定步骤： 挑取1大环培养18h的菌苔入约0.25mL的生理盐水中制成菌悬液，每管加1滴甲苯，摇匀（有助于酶的释放），于37放置5分钟。 在菌悬液中加入0.25mL的0.75mol/L ONPG，测定管置于37水浴培养。经30分、1、2、3、24h进行观察，如有黄色者则为阳性。,2.2 简捷分类（

45、分类到属）,在实际生产中，常常要进行的菌种判别的要求并不高，而只希望快速而简单，主要进行下列四项实验，就可判断常见常用细菌的属： 显微镜观察，球菌还是杆菌 革兰氏染色，阳性还是阴性 产芽孢试验 VP试验 简捷分类表,细菌球状 杆状 革兰氏染色 革兰氏染色 G+ G- G+ G- 奈氏菌属 肠杆菌及其它G-菌 V-P试验 芽孢染色 葡萄球菌属 链球菌属 芽孢杆菌属 短杆菌属梭状芽孢杆菌属 棒状菌属,2.3 发酵工业中常用常见细菌,2.3.1 肠膜状明串珠菌 形态特征：球状，成对或成链，G+，无芽孢，菌落灰白，小，有荚膜 生理特征：微需氧或兼性厌氧，适温2030，超过55死亡，生长在含糖浓度高的培

46、养基中 生化特征：不液化明胶，能利用多种糖产酸产气，不还原硝酸盐，不产生吲哚，生长需谷氨酸、缬氨酸 与生产关系：生产葡聚糖（可作代血浆） 同属：蚀橙明串珠菌、戊糖明串珠菌（可作乳制品发酵菌种）,2.3.2 枯草芽孢杆菌 形态特征：杆状，G+，有芽孢，无荚膜，鞭毛周生或侧生，菌落粗糙。 生理特征：好氧或兼性厌氧，适温3039 生化特征：液化明胶（能产生蛋白酶），胨化牛奶，利用淀粉，还原硝酸盐 与生产关系：蛋白酶、淀粉酶生产用菌 同属：苏云金芽孢杆菌、炭疽杆菌 2.3.3 醋化醋杆菌 形态特征：杆状；革兰氏染色幼龄G-，有的菌株老龄不稳定；无芽孢；运动或不运动 生理特征：严格好氧，适温30，PH

47、46.3 生化特征：乙醇、乳酸盐是良好碳源，不利用乳糖、糊精和淀粉 与生产关系：酿醋（加乙醇能氧化为醋酸） 同属：胶醋酸杆菌（使醋变质，生产中应除去）、纹膜醋酸杆菌（使葡萄酒发酸）,2.3.4 德氏乳酸杆菌 形态特征：杆状，成链状排列，无芽孢，不运动，革兰氏染色不稳定（G+G-），菌落粗糙 生理特征：厌氧，适温4044，PH 5.55.8，在平皿上不形成菌落，而通入510CO2能形成菌落 生化特征：不胨化牛奶，不产生吲哚，不产生H2S，接触酶、氧化酶阴性，营养要求复杂，需氨基酸、短肽、维生素、核酸衍生物，能利用糖产酸不产气 与生产关系：制作酸乳、干酪发酵菌剂 同属：干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌,

48、2.3.5 乳链球菌 形态特征：球状，链状排列，无芽孢，革兰氏染色G+，不运动 生理特征：兼性厌氧，适温37，PH 6.87.2，在6.5NaCl培养基中能生长 生化特征：能发酵多种糖产酸，不液化明胶，不胨化牛奶，不水解淀粉，对石蕊牛奶有还原作用，营养要求复杂，需氨基酸、嘌呤、维生素、短肽 与生产关系：酸乳制品的发酵菌剂 同属：化脓链球菌、溶血性链球菌（能引起咽喉病）,2.3.6 大肠埃希氏杆菌（粪便污染指示菌） 形态特征：杆状，近球菌，单个或成对，G-，无芽孢，有荚膜，菌落白色 生理特征：需氧或兼性厌氧，适温37，寄生于温血动物的肠道内，离开肠道可生存数月 生化特征：能分解利用多种糖（葡萄糖

49、、乳糖、麦芽糖）产酸产气，能利用尿素，不胨化牛奶，不液化明胶，利用丝氨酸能产生吲哚，甲基红阳性，V-P试验阴性，H2S阴性 与生产关系：粪便污染指示菌，是谷氨酸脱羧酶、天冬氨酸酶的生产菌种，苏氨酸、缬氨酸生产菌种，基因工程“工程菌”（接受外源基因） 同属：（致病性）大肠杆菌,2.3.7 丙酮丁醇梭菌 形态特征：杆状，单个或成对，G+，有芽孢（膨大），运动或不运动 生理特征：专性厌氧，适温37，PH 6.07.0 生化特征：液化明胶，使石蕊中乳产酸凝固、产气，不胨化牛奶，能利用多糖、淀粉、糊精，生产丙酮、丁醇、乙醇、丁酸 与生产关系：生产丙酮、丁醇 同属：巴氏芽孢梭菌（能固定N2）、溶纤维芽孢梭菌（能分解纤维素）、肉毒芽孢梭菌（分解蛋白质能力很强）、破伤风芽孢梭菌（无分解糖、蛋白质能力，只能利用氨基酸作为碳源、氮源）,