1、微生物学,第二章 微生物的纯培养和显微技术,基本概念,1、微生物的纯种分离：将多种混杂的微生物，经某种技术或方法分离或纯化的过程。 2、微生物的培养物（culture)：在人为规定的条件下培养、繁殖得到的微生物群体。纯培养物（pure culture)：在人为规定的条件下培养、繁殖得到的只有一种微生物的培养物。,3、菌落（colony):分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度形成的肉眼可见、有一定形态结构的子细胞生长群体。当固体培养基表面众多菌落连成一片时便成为菌苔。 4、培养平板（culture plate):冷却凝固后的固体培养基在无菌培养皿中所形成的培养基固体平面，
2、简称平板，是用于微生物纯培养的最常用的固体培养基形式。,第一节 微生物的分离和纯培养,一、无菌技术（aseptic technique） 在分离、转接及培养纯培养物时防止其被其他微生物污染，其自身也不污染操作环境的技术被称为无菌技术 。,1、微生物培养的常用器具：试管、玻璃烧瓶、培养皿、吸管。,2、最常用的灭菌方法：高压蒸汽灭菌其他方法：干热灭菌 紫外线灭菌过滤除菌火焰烧灼,电热干燥箱,3、接种操作,必备,双管移植法,无菌操作箱,二、用固体培养基获得纯培养,适用于大多数细菌、酵母菌以及许多真菌和单细胞藻类。 1、涂布平板法（Spread Plate method） 2、稀释倒平板法 3、平板划
3、线法（Streak Plate） 4、稀释摇管法（厌氧培养法）,1、涂布平板法（Spread Plate method）,特点：简单易行，但易造成机械损伤,步骤： 制板 稀释 加菌液 涂布 培养 挑菌落,2、稀释倒平板法,步骤： 稀释 加菌液 浇培养基 培养 挑菌落,稀释样品的取样和倾注平皿,每个稀释度 做两个平皿,将凉至46营养琼脂培养基注入平皿约15ml，并转动平皿，混合均匀。,1.取样,倾注平皿,1：10稀释液 225mL无菌水,1mL,1mL,9mL稀释液 1：100,9mL稀释液 1：1000,1mL,1mL,1mL,1mL,1mL,1mL,1mL,1ml无菌水,25g或25ml 检
4、样,3、平板划线法（Streak Plate）,特点：快速、方便。,步骤： 制板 接种环灭菌 挑菌落/ 菌液 划线 培养 挑菌落,4、稀释摇管法（厌氧培养法）用于厌氧菌的培养,灭菌石蜡 和固体石 蜡密封,将待分离的样品进行连续稀释得到高度稀释的效果, 如果经过稀释后的大多数试管中没有微生物生长,那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是由一个微生物个体繁殖而来的纯培养物. 这种方法适合于细胞较大的微生物.,三、用液体培养基获得纯培养,四、单细胞（单孢子）分离法,采用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养的方法。该方法要在显微镜下进行。 毛细管法：用毛细管提取微生物
5、个体，适合于较大微生物。 显微操作仪：用显微针、钩、环等挑取单个细胞或孢子以获得纯培养。 小液滴法：将经过适当稀释后的样品制成小液滴，在显微镜下选取只含一个细胞的液滴来进行纯培养物的分离。,适应于高度专业化的科学研究,五、选择培养,为了从混杂的微生物群体中分离出某种微生物，可以根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用选择培养的方法进行分离。,1、利用选择培养基进行直接分离 2、富集培养,1、选择平板培养根据微生物的特点，在培养基中加入一些抑制剂，使不需要的菌不生长，需要的菌生长后有一定特征，然后挑取单菌落。分离抗生素抗性菌株，可在加有抗生素的平板上分离。分离蛋白酶产生菌，可在培养基
6、中加入牛奶或酪素，蛋白酶产生菌在平板上生长会形成透明的蛋白质水解圈。,2、富集培养,主要是指利用不同微生物间生命活动特点的不同，制定特定的环境条件，使仅适应于该条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加，更容易从混杂的群体中分离到特定的微生物。富集条件可从多方面选择，如温度、pH、紫外线、高压、光照、氧气、营养等等。例如：分离产芽孢细菌，可以对样品进行高温处理，然后再进行培养。,保证菌种经过较长时间后仍保持生活能力，防止被杂菌污染，形态特征和生理形状尽可能不发生变异。,基本要求：,用于长期保藏的原始菌种称为 保藏菌种或原种（stoch culture）。,六、微生物的保藏技术,菌种保
7、藏的原理,首先，要挑选典型菌种的优良纯种，最好采用它们的休眠体进行保藏。,其次，创造一个使微生物代谢不活泼、生长受抑制的环境条件（低温、干燥、缺氧、避光、缺少营养）。,再次，添加保护剂或酸碱中和剂，避免保藏过程中细胞受伤。,菌种保藏的方法,一种良好的菌种保藏方法,保持原菌的优良性状长期稳定,方法的通用性,操作的简便性,设备的普及性,菌 连续在培养基上（内）移种种 生活态 传代培养保藏法 连续在活宿主上（内）移种保 固体斜面藏 湿法 半固体琼脂柱方 休眠态 液体介质（蒸馏水、糖液、其它溶液）法 干法 藏在玻璃管内吸附在合适的载体上,微生物菌种保藏的方法,优点：方便，不受条件限制，各类微生物均可。
8、 缺点：时间短、传代多、易退化。,低温可减缓生长速度，单细胞仍有一定的活动条件，一般46个月必须传代一次。,斜面低温保藏法 方法：菌种管置4冰箱保藏，定时传代 原理：低温下，微生物代谢强度明显下降 。,1、传代培养保藏方法,石蜡油低温保藏法：,操作方法： 生长完全的斜面上覆盖无菌的液体石蜡，液面高于斜面1cm，普通冰箱保藏。,原理：在长好的斜面菌上覆盖灭菌的液体石蜡， 达到菌体与空气隔绝，使菌处于生长和代谢停止状态， 同时石蜡油还防止水分蒸发， 在低温下达到较长期的保藏菌种的目的。,优点：保藏时间12年，方便，除石油发酵微生物外， 各类微生物均可。 缺点：时间短、传代多、易退化。,衰退（deg
9、eneration） ：菌种在培养或保藏过程中，由于自发突变的存在，出现某些原有优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象，称为菌种的衰退。 衰退的原因：基因突变，分离现象。 常见的衰退现象： 菌落和细胞形态的改变； 生长速度缓慢，产孢子越来越少； 抵抗力、抗不良环境能力减弱等； 代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力下降。,菌种的衰退,防止菌种衰退的方法： 控制传代次数（一般在DNA的复制过程中，碱基的错配率是5x10-4，自发突变的频率为10-810-9，采用良好的菌种保藏方法，可以减少移种和传代的数）； 选择合适的培养条件； 采用不同类型的细胞进行传代（对丝状微生物而言，通常采用稳定的单核孢子
10、进行接种）； 采用有效的菌种保藏方法。,液氮超低温保藏法 将菌种置于保护剂（ 甘油、二甲亚枫、血清蛋白、脱脂牛奶等）中，预冻后保存在液氮中（ -196）或低温冰箱（ -70）。 适用于各种微生物的较理想的保藏方法。,优点：保藏效果好。 缺点：价格昂贵低，温度对细胞有损伤。,2、冷冻保藏低于70,冷冻真空保藏法,操作方法： 是将液体样品（含保护剂的菌悬液）在冻结状态下升华其中水分，最后达到干燥、缺氧、低温的状态。 培养物用保护剂制成菌悬液，加入安瓶中，冷冻、抽真空、封口。 适用于各种微生物，便于大量保藏，菌种存活时间长，是目前最好的保藏方法。,3、干燥保藏法,优点：低温、干燥、无氧、有保护剂，可
11、保藏各大类微生物，保藏时间可达几十年，是目前使用最广、最有效的保藏方法。一般专业机构大都使用此法保藏。 缺点：不能保藏真菌菌丝。,干燥保藏法将菌种置于土壤、细纱、滤纸、硅胶等干燥材料上保藏。如砂土管保藏法，适用于放线菌、芽孢菌和某些真菌保藏，保藏时间几至几十年。,几种常用菌种保藏方法的比较,菌种保藏机构的任务：广泛收集科研和生产菌种、菌株，并加以妥善保管，使之达到不死、不衰、不乱以及便于研究、交换和使用的目的。 菌种保藏机构：中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM) 美国的典型菌种保藏中心(ATCC)英国国家典型菌种保藏所（NCTC）法国里昂巴斯德研究所（IPL）,国内外菌种保藏机构：,任务： 广泛收集实验室和生产用菌种、菌株、病毒毒株 （有时还包括动、植物的细胞株和微生物质粒等）， 并将它们妥善保藏，使之不死、不衰、不乱， 便于研究、交换和使用。,国家设立专门的菌种保藏机构,思考题 1、用固体培养基分离纯培养的方法有哪些，如何操作？ 2、菌种保藏的方法有哪几种，各自的优缺点是什么。,再 见,
