1、绪论分子生物学(molecular biology）:是在分子水平研究生命现象的科学，是现代生命科学的共同语言。核心内容是通过生物的物质基础核酸 、 蛋白质 、 酶 等生物大分子的结构、功能及其相互作用等运动规律的研究来阐明生命分子基础，从而探讨生命的奥秘。药学分子生物学(pharmaceutical molecular biology)：由于分子生物学的新理论、新技术渗入到药学研究领域，从而使药物学研究以化学、药学的培养模式转化为以生命科学、药学和化学相结合的新药模式。分子生物学的主要研究对象：核酸、蛋白质、酶等生物大分子的结构、功能及相互作用分子生物学在医药工业中的应用：1、DNA 重组技
2、术与新药研究2、药物基因组学、药物蛋白质组学与现代药物研究3、药物蛋白质组学是基因、蛋白质、疾病三者相连的桥 梁科学第 1 章 核酸的分子结构、性质和功能核酸的基本结构（重点掌握）： 磷酸核苷 碱基戊糖引起 DNA 构象改变的因素：核苷酸顺序、碱基组成、盐的种类、相对湿度。DNA 双螺旋结构 有利 氢键 不利 疏水力稳定性的影响： 碱基堆积力 静电斥力mRNA: 遗传信息真核生物的 mRNA 结构:5帽子 5非编码区 编码区 3非编码区3polyA原核生物的 mRNA 结构：5非编码区 调控序列编码区终止子 起始调控序列编 码区终止区3非编码区tRNA 的二级结构：三叶草形三级结构：倒 L 形
3、功能： 接受氨基酸、携带氨基酸，把氨基酸转运到核糖体上，然后按照 mRNA 上的密码顺序装配成多肽或蛋白质。rRNA：组成核蛋白体核酸分子杂交的原理：复性（变性的 DNA 重新恢复成双链的过程称为复性也叫做退火。 ）反义 RNA 的作用机制（掌握）：类反义 RNA:直接作用于靶 mRNA 的 S D 序列和(或)部分编码区，直接抑制翻译，或与靶 mRNA 结合形成双链 RNA，从而易被 RNA 酶 降解；类反义 RNA：与 mRNA 的非编码区结合，引起 mRNA 构象变化，抑制翻译；类反义 RNA：则直接抑制靶 mRNA 的转录。 双链 RNA 诱导诱导 RNAi 的过程主要分为两个阶段（重
4、点掌握）：启动阶段 执行阶段启动阶段：当细胞中由于感染等原因出现双链 RNA 分子时，细胞中一种称为 Dicer 的核酸酶就会识别这些双链 RNA，并将其降解成 21-23bp 长的小干扰 RNA（siRNA） ，单链 siRNA 与一些蛋白形成复合体，构成“RNA 诱导的沉默小体” （RISC）执行阶段：当目标 mRNA 与 RISC 中的 siRNA 完全配对时，RISC 就会切割目标 RNA，并由细胞中的核酸酶将其进一步降解，从而抑制目标基因的表达病毒核酸的特点（了解）：（1）病毒只含一种核酸，构成病毒体的心髓。 （2）核酸类型多态化（3）分子量小，基因组结构简单，所含基因组数目少（4）
5、病毒基因组核酸复制多样化（5）病毒核酸更易受宿主细胞的影响而发生基因突变和重组（6）有些病毒去除囊膜和衣壳，裸露的 DNA 或 RNA 也能感染细胞， 这样的核酸成为传染性核酸 第二章 染色质、染色体、基因和基因组染色质和染色体的化学成分和组成：DNA:脱氧核糖、磷酸、碱基组蛋白：碱性氨基酸，带正电，如精氨酸、赖氨酸。非组蛋白：酸性氨基酸，带负电，如天冬氨酸、谷氨酸。少量 RNA酶DNA 和组蛋白的含量比较恒定，非组蛋白的含量变化较大，RNA的含量最少。基因的定义：基因的生物学定义:是携带生物遗传信息的结构单位，又是控制一个特定性状的功能单位。基因的分子生物学定义：指 DNA 分子中能编码一条
6、多肽链，并且具有一定长度的片段。严格地说，基因不仅包含编码蛋白质肽链或 RNA 的核酸序列，还包括为保证转录所必须的调控序列。基因组(genome)：是细胞中一套完整单体遗传物质的总和。基因组结构的异同：原核生物 真核生物基因组很小 基因组庞大复杂，含多种序列成分几乎无蛋白质和核酸结合 和蛋白质结合形成染色体有操纵子结构 基因家族化，有重复序列基因多连续，有重叠基因（真核细胞病毒除外）基因不连续多顺反子 单顺反子以单拷贝和多拷贝两种形式存在 以单拷贝和多拷贝两种形式存在第三章、可移动的遗传因子（转座子)和染色体外的遗传因子转座子(transposon)：原核生物和真核生物基因组中存在着可以从
7、一个部位转移到另外一个部位的 DNA 序列，这些序列称为转座子。逆转录转座子（retransposon）:指内部含逆转录酶编码序列，通过DNA RNA DNA 方式进行转座，即转座子转录产生相应的 RNA，再经过逆转录生成新的转座子 DNA 并整合到基因组中。质粒（plasmid）:是多数细菌和某些真核生物细胞染色体外的双链环状 DNA 分子。遗传重组（genetic recombination）:减数分裂时，通过同源染色体的交换和非同源染色体的独立分配，使子代细胞的遗传信息产生了重新组合，这种现象称为遗传重组。同源重组（homologous recombination）:指发生在两条双链 D
8、NA 的同源序列之间，涉及的是大片段同源 DNA 序列的交换。位点特异重组（site-specific recombination）:指不依赖于 DNA 序列的同源性，而依赖于能与某些酶相结合的特异 DNA 序列的重组。简述原核生物转座子的类型及组成特点：IS两端有 ITR,只能编码转座酶；类转座子结构同 IS，但不能独立存在，仅作为复合转座子的两端组件；复合转座子两端由 IS 或类 IS 构成，可编码抗性物质；TnA 转座子家族两端为 ITR,可编码转座酶、解离酶和抗性物质。解释逆转录病毒与逆转录转座子的区别： 转录病毒是具有 感染能力 的病毒颗粒，可以在细胞之间转移；逆转录转座子是宿主 D
9、NA 基因组的组分，可以在基因组内转座，但是不能在细胞之间转移。简述质粒 DNA 特性：质粒的复制 严密型质粒的复制松弛型质粒的复制质粒的不相容性质粒的转移性质粒的选择性标记试述大肠杆菌同源重组酶的特点（p92）：RecBCD:具有 外切核酸酶 活性，序列特异性的单链内切酶的活性和解旋酶活性使 DNA 产生具有游离末端的单链、ATPase 活性水解 ATP为解旋提供能量；RecA：有单、双链 DNA 结合活性，有 ATPase 的活性，并且促进各种 DNA 分子进行同源配对或分子入侵，形成同源配对的联合分子；RuvAB：RuvA：识别 Holliday 结构的连接点RuvB：为分枝迁移提供动力
10、（ATPase）凭借其解旋酶活性，推动 Holliday 中间体的分支迁移；RuvC：是一种核酸内切酶-专一性识别 Holliday 结构的连接点。同源重组与位点特异重组有何不同： 同源重组中 DNA 链的切断可能是随机的；位点特异性重组是在某些特异的 DNA 序列处发生重组。 同源重组后染色体内的 DNA 序列一般仍按原来的顺序排列；位点特异性重组中 DNA 节段的相对位置发生了移动，即 DNA序列发生重排，从而得到不同的结果。Holliday 模型的步骤：1、两个 DNA 分子单链的同一部位发生断裂；2、两个断裂的单链的游离末端彼此交换，连接形成 holliday 连接体；3、通过分支移动
11、产生同另一分子的互补序列形成异源双链DNA；4、Holliday 交叉的上部或下部旋转 180，中间体切开并修复，形成两个双链重组体的 DNA。分别为片段重组体和拼接重组体。第 4 章 DNA 的复制、突变、损伤和修复复制（replication）:遗传物质的传代，以母链 DNA 为模板合成子链DNA 的过程。半保留复制：DNA 生物合成时，母联 DNA 解开为两条单链，各自作为模板按碱基配对规律，合成与模板链互补的子链。子代细胞的 DNA ，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。复制子：两个复制起始点之间的 DNA 片段。复制叉：DNA 分子复制时，复制起点两条链解开成单链
12、状态所形成的Y 形结构称为复制叉。使 DNA 链解离的酶：（1）解旋酶利用 ATP 供能，作用于氢键，使 DNA 双链解开成为两条单链。（2）单链 DNA 结合蛋白 SSB在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整。（3）DNA 旋转酶（拓扑异构酶）改变 DNA 超螺旋状态、理顺 DNA 链。DNA 聚合酶：原核生物：DNA-pol: 对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补DNA-polDNA-pol: 是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。真核生物：DNA 聚合酶 ：合成后随链，引物酶活性DNA 聚合酶 ：DNA 修复DNA 聚合酶 :先导链合成DNA 聚合酶 ：线粒体
13、 DNA 的合成DNA 聚合酶 ：机制不明类似于 端粒：真核生物染色体线性 DNA 分子末端的结构。端粒的结构特点：1、由末端单链 DNA 序列和蛋白质构成。2、末端 DNA 序列是多次重复的富含 G、C 碱基的短序列。端粒的功能：1、维持染色体的稳定性；2、维持 DNA 复制的完整性端粒酶的组成：端粒酶 RNA；端粒酶协同蛋白；端粒酶逆转录酶影响端粒酶的药物：1、反义核酸；2、核酶；3、逆转录酶抑制剂：3-叠氮胸苷（AZT）线粒体 DNA 复制：D 环复制噬菌体和病毒 DNA 的复制：滚环复制AZT 的作用原理：逆转录酶合成病毒 DNA 时，AZT 掺入到病毒 DNA 中，由于 AZT 的
14、3-OH 被叠氮取代，所以不能合成 3-5磷酸二酯键，使病毒 DNA 合成终止。 （HIV 治疗）突变可分为：自发突变；诱发突变突变类型 碱基置换突变 点突变 （转换、颠换） 单点突变碱基插入（较长） 多点突变碱基缺失（较长）移码突变：插入、缺失一个或两个碱基引起阅读框架的改变 移码突变：是指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。 根据密码子遗传信息改变分类：同义突变、错义突变、无义突变根据突变表现型对外界环境的敏感性分类：非条件性突变、条件性突变突变型与野生型的变换：正相突变、回复突变突变原因：（一）自发突变（脱氨基、脱嘌呤） （二）诱发突变射线化学诱变剂（）碱基类似物
15、 （）氨基嘌呤（）碱基修饰剂（亚硝酸、羟胺、烷化剂）（）插入剂（3）基因的人工诱变DNA 的修复系统： 尿嘧啶糖基酶系统一、复制修复 错配修复无嘌呤（AP）修复光复活修复 二、损伤修复 甲基转移酶修复切除修复三、复制后修复 大肠杆菌的重组修复系统SOS 修复光复活修复（原理）：胸腺嘧啶在 uv 的作用下生成 TT 二聚体（胸腺嘧啶二聚体） ，光复活酶在蓝光的照射下激活，是二聚体解离。限制与修饰 限制：限制性内切酶切断外来的 DNA修饰：甲基化酶保护细胞自身的 DNA渥曼青霉素的作用机制：（抑制肿瘤细胞）抑制 DNA 损伤修复的蛋白激酶的活性，DNA 的修复功能减弱，增加多耐药细胞对化疗药物的敏
16、感性。第 5 章 转录 、转录后加工转录（transcription）：生物体以 DNA 为模板合成 RNA 的过程。转录单位：RNA 链的生物合成起始于 DNA 模板的一个特定位点，并在另一位点处终止，这一特定区域称为转录单位。（位于转录起点到转录终点之间的 DNA 模板区域。 ）不对称转录：转录选择性称为不对称转录。有两方面含义：（1）在 DNA 分子双链上，一股链用作模板指引转录，另一股链不转录；（2）模板链并非总是在同一单链上复制与转录相同点：以 DNA 为模板；由 5向 3方向延长；反应体系需要Mg2+区别：启动子（promoter）：是指 RNA 聚合酶识别、结合并起始转录的位于转
17、录单位上游的一段具有高度保守性 DNA 序列。原核生物启动子：1、转录起始点保守序列2、-10 序列(Pribnow 框）3. -35 序列(Sextama 框）4. 作用部位间隔区: 17bp 转录效率最高5. CAP 结合位点RNA 聚合酶 II 的启动子结构：1、起始子；2、TATA 框(-25)；3、CAAT 框(-75)；4、 GC 框(-90)；5、增强子(远上游序列)增强子（enhancer):1、远上游序列；2、转录频率增强；3、增强效应与其位置和方向无关；4、大多为重复序列；5、组织特异性、细胞特异性；6、无基因专一性；7、受外部信号调控原核生物转录起始：需要 RNA 聚合酶
18、全酶（；两个 、,后四个为核心酶） 因子：NTP 酶的活性；解旋酶的活性。茎环结构使转录终止的机理：（非依赖 因子的终止）使 RNA 聚合酶变构，转录停顿；使转录复合物趋于解离，RNA 产物释放。转录因子(transcriptional factors, TF) ：RNA 聚合酶在起始转录时，需要一些辅助因子（蛋白质）参与作用，称之为转录因子。 （真核生物）RNA 生物合成抑制剂：利福霉素：抑制 细菌 RNA 聚合酶（抑制聚合酶的活性 起始阶段）利迪链霉素：抑制 细菌 RNA 聚合酶（作用于 亚基抑制延长）a-鹅膏蕈碱：抑制 真核生物 RNA 聚合酶（抑制聚合酶活性）真核生物 mRNA 前体加
19、工：（1）5 端加帽（加帽酶；甲基转移酶；5-5 三磷酸二酯键；5端有 N7-甲基鸟苷酸） ；（2）3 末端 PolyA（聚腺苷酸化）;（3）内含子剪接；（4）甲基化帽子结构的功能: 1、增加 mRNA 稳定性，使 mRNA 免遭核酸酶的攻击。2、为核蛋白体识别 mRNA 提供信号，促进蛋白质的生物合成。3、促进某些 RNA 的合成。 内含子分类：I： 线粒体、叶绿体及某些低等真核生物,转录产物是 rRNAII：线粒体、叶绿体，转录产物是 mRNA III：细胞核，形成套索结构，转录产物是 mRNA IV：转录产物是 tRNA第 I 类的内含子的自我剪接：转录产物是 rRNA 自身催化过程（经
20、过两次转酯反应）：（1）鸟核苷-OH 攻击第一个外显子与内含子之间的磷酸二酯键（2）第一个外显子 3-OH 攻击内含子与第二个外显子之间的磷酸二酯键（3）两个外显子相连第 III 类的内含子的自我剪接：GU-AG 规则（套索结构）tRNA 前体的加工：1、 核酸内切酶在 tRNA 两端切断2、核酸外切酶在 3端逐个切去附加的碱基3、在 3端加上-CCA -OH4、核苷的修饰(碱基修饰：甲基化；还原反应；核苷内的转位反应；脱氨反应)。第六章 蛋白质生物合成翻译及翻译后过程 蛋白质生物合成的概念蛋白质生物合成也称翻译，是生物细胞以 mRNA 为模板，按照 mRNA 分子中核苷酸的排列顺序所组成的密
21、码信息合成蛋白质的过程。蛋白质生物合成体系：基本原料：20 种编码氨基酸模板：mRNA适配器：tRNA装配机：核蛋白体主要酶和蛋白质因子：氨基酰-tRNA 合成酶、转肽酶、起始因子、延长因子、释 放因子等能源物质：ATP、GTP无机离子：Mg2+、 K+开放阅读框架(open reading frame, ORF) ：从 mRNA 5-端起始密码子AUG 到 3-端终止密码子之间的核苷酸序列，称为开放阅读框架密码子（codon ）：在 mRNA 的开放阅读框架区，以每 3 个相邻的核苷酸为一组，代表一种氨基酸(或其他信息)，这种三联体形式的核苷酸序列称为密码子。遗传密码的性质：方向性、连续性、
22、简并性、摆动性、通用性、偏爱性摆动性： 反密码子与密码子之间的配对有时并不严格遵守常见的碱基配对规律，这种现象称为摆动配对。原核生物 mRNA 的特点（重点）1、 半衰期较短，仅为几分钟2、SD 序列: 起始 AUG 上游, -AGGA-保守序列，是核蛋白体结合位点。3、多顺反子：原核细胞中数个结构基因常串联为一个转录单位，转录生成的mRNA 可编码几种功能相关的蛋白质，为多顺反子(polycistron) 。真核生物 mRNA 的特点（重点）1、转录和翻译分别在细胞核和细胞浆中完成。2、半衰期相对较长（几小时甚至几天）3、Kozak 序列：mRNA 起始密码子处的一段保守序列-CCACCAU
23、GG-，能增加翻译起始的效率。4、单顺反子真核生物: 起始氨基酰-tRNA: Met-tRNAiMet 参与肽链延长的甲硫氨酰-tRNA：Met-tRNA Met原核生物：起始氨基酰-tRNA: fMet-tRNAfMet N-甲酰甲硫氨酰-tRNA原核生物 mRNA 在核蛋白体小亚基上的准确定位和结合涉及 两种机制：1.小亚基中的 16S-rRNA 3-端有一富含嘧啶碱基的短序列，通过与S-D 序列碱基互补而使 mRNA 与小亚基结合。2.mRNA 序列上紧接 S-D 序列后的核苷酸序列，可被核蛋白体小亚基蛋白 rpS-1 识别并结合。原核生物的肽链合成起始：指 mRNA 和起始氨基酰-tR
24、NA 分别与核蛋白体结合而形成翻译起始复合物的过程。（1） 核蛋白体大小亚基分离；（IF-3）（2） mRNA 在小亚基定位结合；（3） 起始氨基酰-tRNA 的结合； (IF-1、IF-2、GTP)（4） 核蛋白体大亚基结合。延长：1. 进位(positioning)/注册(registration)(EF-Tu 和 EF-Ts 催化)2. 成肽(peptide bond formation)（肽酰基转移酶）3. 转位(translocation) （转位酶）核蛋白体循环：肽链延长在核蛋白体上连续循环式进行，又称为核蛋白体循环。多聚核蛋白体：1 条 mRNA 模板链都可附着 10100 个核
25、蛋白体，这些核蛋白体依次结合起始密码子并沿 53方向读码移动，同时进行肽链合成，这种mRNA 与多个核蛋白体形成的聚合物称为多聚核蛋白体 。蛋白质生物合成阻断剂（P205208）1. 抗生素类阻断剂（嘌呤霉素、氯霉素、放线菌酮）2. 抗代谢药物（长春新碱、三尖杉酯碱）3. 白喉毒素（使 eEF-2 失活-糖基化，阻断蛋白质合成）4. 干扰素 (使 eIF-2 失活- 磷酸化; 降解病毒 mRNA)分子伴侣：是细胞内一类可识别肽链的非天然构象、促进各功能域和整体蛋白质的正确折叠的保守蛋白质。分子伴侣有以下功能：封闭待折叠蛋白质的暴露的疏水区段；创建一个隔离的环境，可以使蛋白质的折叠互不干扰；促进
26、蛋白质折叠和去聚集。翻译后加工修饰：（一）侧链氨基酸的微小修饰1. 二硫键的形成2.甲基化、磷酸化及乙酰化（二）剪切和剪接加工1新生肽链 N 端的切除 2剪切 （1）信号肽的切除 （2）前体蛋白加工（3）活性肽的剪切释放（三）添加化学基团第八章 基因工程及其在医药工业的应用基因工程的基本原理（简答题）：获取目的基因 选择和构建载体 目的基因与载体的连接 重组体导入受体细胞重组体的筛选 克隆基因的表达限制性内切酶切割后产生的 3 种粘性末端：5-粘性末端；3- 粘性末端；平头末端影响限制性内切酶活性的因素：1、 DNA 的纯度2、DNA 甲基化程度3、底物 DNA 的分子构型4、反应温度5、反应
27、系统组成：缓冲液、pH 等6、酶量、反应体积、酶切时间合理使用DNA 连接酶 (DNA ligase)：催化 DNA 中相邻的 5-磷酸基和 3-羟基末端之间形成磷酸二酯键，使 DNA 切口封合或使两个 DNA 分子或片段连接。DNA 连接酶的分类：(1) T4 噬菌体 DNA 连接酶 连接粘性末端或平末端的 DNA 分子(2)大肠杆菌 DNA 连接酶 只能连接粘性末端DNA 和 RNA 的修饰酶：末端脱氧核苷酸转移酶同聚物加尾碱性磷酸酶切除 5-末端的磷酸限制酶在 DNA 的任何部位都能将 DNA 切开吗？不能。 限制性核酸内切酶识别 DNA 的特异序列（回文序列） ， 并在识别位点或其周围
28、切割双链 DNA。DNA 聚合酶和 DNA 连接酶有何不同点？1、DNA 连接酶：主要是连接 DNA 片段之间的磷酸二酯键，起连接作用，在基因工程中起作用。2、 DNA 聚合酶：主要是在 DNA 片段末端连接上单个脱氧核苷酸，在DNA 复制中起作用3、DNA 连接酶是将 DNA 双链上的两个切口同时连接起来。因此 DNA 连接酶不需要模板4、DNA 聚合酶是以一条 DNA 链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的 DNA 链；载体必备条件： 1、能自主复制；2、有多克隆位点（MCS） ；3、具有遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；4、分子量小，以容纳较大的外源 DNA。质粒(
29、plasmid) ：是细菌染色体外的遗传单位，环状双链 DNA 分子。存在于宿主细胞内、独立于染色体外的、自主复制的遗传成分。克隆载体 (cloning vector): 能使插入的外源 DNA 序列被复制、扩增而不能表达，这样的载体为克隆载体表达载体: 为使插入的外源 DNA 序列转录，进而翻译成多肽链而设计的载体称表达载体。蓝白筛选：质粒上存在 LacZ序列，该序列能编码 - 半乳糖苷酶 N端，而细菌染色体能编码 -半乳糖苷酶 C 端, 形成 互补产生了具有活性的 -半乳糖苷酶，培养基里存在的 X-gal 被杂合的 - 半乳糖苷酶水解，形成蓝色化合物，因此在平板上产生蓝色菌落。而 LacZ
30、序列上存在多克隆位点，由于目的基因的插入，破坏了LacZ的结构，无法产生功能性的 -半乳糖苷酶，不能水解 X-gal，不能生成蓝色化合物，所以平板上出现白色菌落，白色菌落为阳性克隆的菌落。DNA 重组: 不同来源 DNA 分子通过共价连接（磷酸二酯键）而组合成新的 DNA 分子的过程。大肠杆菌载体按功能分类：（1）克隆载体（2）表达载体（3）穿梭载体*原核表达载体的表达系统元件是：启动子 -核糖体结合位点 -克隆位点 -转录终止信号大肠杆菌基因表达载体分为 3 个系统：DNA 复制及重组体的选择系统：复制子、选择标记外源目的基因的转录系统：启动子、转录终止子、抑制物基因蛋白质的翻译系统：核糖体
31、结合位点（SD 序列） 、翻译起始密码子、翻译终止密码子穿梭载体（shuttle vector)：原核细胞复制所需的序列结构。真核细胞表达所需的 结构元件 和相应的 选择标记 基因。采用不同方法获取目的基因（简答题）：基因组 DNA 文库cDNA 文库聚合酶链反应化学合成法基因组 DNA 文库（名解）：存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组 DNA 的集合。PCR 反应体系：1、模板 DNA ；2、dNTP；3、引物；4、Tag DNA 聚合酶；5、缓冲液。步骤：模板 DNA 变性；模板 DNA 与引物退火；引物延伸。人工合成基因局限性：1、长度：60bp；2、中性突变：密码子选择需注意
32、；3、二级结构和重复结构影响拼接；4、合成费用高。载体与目的基因的连接主要有以下 5 种连接方式：（选择简答）1、粘性末端连接2、平头末端连接3、衔接体（linker）技术4、同源多聚尾连接法5、人工接头（adaptor ）技术粘性末端的连接方式：（选择）1、插入失活法（单酶切）基因序列未知基因序列已知2、定向克隆法（双酶切）3、载体 5端脱磷法（CIP）基因组 DNA 文库与 cDNA 文库的比较（10 分）：基因组 DNA 文库的构建： cDNA 文库的建立：组织或细胞染色体 DNA mRNA限制性内切酶 反转录酶基因片段 cDNA 第一链克隆载体 复制重组 DNA 分子 双链 cDNA受
33、体菌 载体含重组分子的转化菌 重组 DNA 分子（基因文库） 受体菌cDNA 文库1、cDNA 文库比基因组 DNA 文库小得多。2、从 cDNA 文库筛选基因比较容易。3、基因组 DNA 文库：内含子和外显子4、cDNA 文库：只有外显子感受态细胞(competent cell)： 用特殊方法（CaCL2）处理后，受体细胞才具备接受外源 DNA 的能力， 这种细胞称感受态细胞。重组基因导入原核细胞：CaCl 2 转化法重组基因导入哺乳动物细胞的方法：1、磷酸钙转染；2、电穿孔；3、DEAE 葡聚糖介导转染；4、脂质体转染；5、显微注射。重组体的筛选鉴定方法主要有：1、遗传学方法2、核酸杂交法
34、（鉴定）3、免疫学方法（鉴定）4、利用 PCR 方法筛选重组子5、酶切鉴定6、DNA 测序（鉴定）核酸分子杂交法主要包括：（一）菌落原位杂交（二）Southern 印迹（DNA）（三）斑点印迹（四）Northern 印迹（RNA ）PCR 的基本原理是什么?用 PCR 扩增某一基因，必须预先得到什么样的信息?答：(1)DNA 半保留复制的原理，在体外进行 DNA 的变性、复性和引物延伸。(2)至少要预先知道足够合成一对引物的靶 DNA 序列。第七章 基因表达的调控基因表达(gene expression)： 是基因转录及翻译的过程，即：生成具有生物学功能产物的过程。可诱导基因：在特定 环境信号
35、 刺激下，相应的基因 被激活 ，基因表达产物 增加 ，这种基因称为 可诱导基因。诱导(induction)：可诱导基因在特定环境中 表达增强 的过程，称为诱导(induction)。可阻遏基因：如果基因对 环境信号 应答是 被抑制 ，基因表达产物 减少 ，这种基因是可阻遏基因。阻遏(repression)：可阻遏基因 表达产物水平降低 的过程称为 阻遏(repression)基因表达的调控方式:阻遏负调控:调控蛋白+DNA 序列 基因的表达 (相应蛋白质降低)促进正调控:调控蛋白+DNA 序列 基因的表达(相应蛋白质增加)顺式作用元件：与相关基因处在 同一个 DNA 分子上，起调控作用的DNA
36、 序列 。反式作用因子：对 一个 基因的表达具有调控作用的 另一个 基因的 产物 。乳糖操纵子色氨酸操纵子（转录翻译偶联对基因表达的调控）热休克应答反应：4250，大肠杆菌常规蛋白质合成开始关闭或下降，诱导产生各种热休克蛋白，与 32 有关。沉默子(silencer)：某些基因的负性调节元件，当其结合特异蛋白因子时，对基因转录起阻遏作用。真核生物的基因表达调控：一、 染色体重排的调控二、 染色质水平调控（一）活性染色质DNA 拓扑结构变化；2. 对核酸酶（DNase I)敏感（二）组蛋白的修饰乙酰化修饰 作用：降低核小体的稳定性磷酸化修饰 作用：降低与 DNA 的亲和力三、DNA 水平调控（一
37、）基因的丢失、扩增与重排（二）DNA 的甲基化和去甲基化四、转录水平调控（一）顺式作用元件：启动子；增强子；沉默子（二）反式作用因子转录调节因子分类（按功能特性） 基本转录因子特异转录因子五、翻译水平调控（一） 5UTR 结构（UTR 非翻译区）（帽子结构、mRNA 二级结构、先导序列）（二）蛋白因子磷酸化（三） 3UTR 结构六、小分子 RNA 对基因表达调控（P299）1小干扰 RNA 与基因沉默2微小 RNA 与基因沉默 螺旋- 转角- 螺旋锌指结构碱性亮氨酸拉链转录因子的结构： DNA 结合域 螺旋-环- 螺旋（填空） 酸性激活域转录激活域 谷氨酰胺富活域脯氨酸富含域第七章 基因表达的
38、调控基因表达(gene expression)： 是基因转录及翻译的过程，即：生成具有生物学功能产物的过程。可诱导基因：在特定 环境信号 刺激下，相应的基因 被激活 ，基因表达产物 增加 ，这种基因称为可诱导基因。诱导(induction)：可诱导基因在特定环境中 表达增强 的过程，称为诱导(induction)。可阻遏基因：如果基因对 环境信号 应答是 被抑制 ，基因表达产物 减少 ，这种基因是可阻遏基因。阻遏(repression)：可阻遏基因 表达产物水平降低 的过程称为阻遏(repression)基因表达的调控方式:阻遏负调控:调控蛋白+DNA 序列 基因的表达 (相应蛋白质降低)促进
39、正调控:调控蛋白+DNA 序列 基因的表达(相应蛋白质增加)顺式作用元件：与相关基因处在 同一个 DNA 分子上，起调控作用的DNA 序列 。反式作用因子：对 一个 基因的表达具有调控作用的 另一个 基因的 产物 。乳糖操纵子色氨酸操纵子（转录翻译偶联对基因表达的调控）热休克应答反应：4250，大肠杆菌常规蛋白质合成开始关闭或下降，诱导产生各种热休克蛋白，与 32 有关。沉默子(silencer)：某些基因的负性调节元件，当其结合特异蛋白因子时，对基因转录起阻遏作用。真核生物的基因表达调控：三、 染色体重排的调控四、 染色质水平调控（一）活性染色质DNA 拓扑结构变化；2. 对核酸酶（DNas
40、e I)敏感（二）组蛋白的修饰乙酰化修饰 作用：降低核小体的稳定性磷酸化修饰 作用：降低与 DNA 的亲和力三、DNA 水平调控（一）基因的丢失、扩增与重排（二）DNA 的甲基化和去甲基化四、转录水平调控（一）顺式作用元件：启动子；增强子；沉默子（二）反式作用因子转录调节因子分类（按功能特性） 基本转录因子特异转录因子五、翻译水平调控（一） 5UTR 结构（UTR 非翻译区）（帽子结构、mRNA 二级结构、先导序列）（二）蛋白因子磷酸化（三） 3UTR 结构六、小分子 RNA 对基因表达调控（P299）1小干扰 RNA 与基因沉默2微小 RNA 与基因沉默 螺旋- 转角- 螺旋锌指结构碱性亮氨
41、酸拉链转录因子的结构： DNA 结合域 螺旋-环- 螺旋（填空） 酸性激活域转录激活域 谷氨酰胺富活域脯氨酸富含域第九章 基因敲除与药学基因敲除（gene knockout）：在转基因技术和 DNA 分子间的同源重组的基础上发展的高新技术，对生物体中的目标基因（结构已知，功能未知）进行特异性的修饰和改造，或用序列相近的基因取而代之，由此使生物体的性状发生改变，观察实验动物的整体效应，从而推测相应基因的功能以及建立相关疾病治疗模型等。二、基因敲除载体导入 ES 细胞1. 显微注射法2. 电穿孔法（常用）3. 病毒感染法（常用）4. DNA-磷酸钙共沉淀法5. DEAE 葡聚糖介导法6. 脂质体法四、基因敲除动物的产生1.显微注射法2.胚胎聚合法3.核移植法条件性基因敲除（conditional gene knockout）：是一种将目标基因的敲除限制在某一特定的组织、细胞或发育的特定阶段的特殊的基因敲除方法。
