1、白蛋白的分离纯化与鉴定,生物化学教研室,蛋白质综合性实验,蛋白质盐析,葡聚糖凝胶-25脱盐,DEASephadex离子交换纯化,蛋白质浓度检测,SDS PAGE电泳法,（鉴定蛋白质纯度和分子量）,实验操作：,盐析：,0.5ml血清 0.5ml饱和 硫酸铵,混匀,5000rpm离心10min,上清：白蛋白,沉淀：球蛋白,将上清转移另一Ep管(尽可能吸尽上清).待用 沉淀+0.6mlddH2O溶解， 5000rpm5min离心，留上清液备用.,清洗层析柱，垂直安装好层析柱，装入蒸馏水,检查是否漏液；层析柱内是否有气泡 。如果有气泡，必须想办法排除 装柱：；悬浮葡聚糖凝胶，装入柱中，凝胶边沉降，边加
2、入凝胶。床内不得有界面和气泡。床上表面平整。 平衡：接恒压储液瓶，用0.02M缓冲液洗脱平衡。调节流速1ml/min；设定自动部分收集器的收集时间（2ml/tube）。 层析床检查：床内不得有界面和气泡。床上表面平整。兰色的葡聚糖2000进行层析行为的检查 加样及洗脱： 收集和测定：用自动部分收集器 清洗平衡：收取蛋白后继续用缓冲液洗脱约2个柱体积，也可用考马斯亮兰检测无蛋白质的流出液。,葡聚糖凝胶柱层析,离子交换柱层析(DE-52),清洗层析柱,垂直安装好层析柱,检查是否漏液与气泡。 装柱：悬浮液装柱；介质高度8-10cm. 平衡：缓冲液洗脱平衡（至少10倍柱体积）。调节流速0.5ml/mi
3、n；设定自动部分收集器的收集时间（2ml/tube） 加样:第一次上球蛋白第二次上白蛋白 洗脱：第一次用0.02mol/L、0.06mol/L、 NH4Ac梯度洗脱球蛋白.第二次用0.3 mol/L NH4Ac梯度洗脱白蛋白。 收集和测定：自动部分收集器 2ml/tube 清洗再生：1.5mol/L NaCl+0.3mol/L NH4Ac缓冲液洗脱。,注意事项： 1、严防空气进入层析柱发生裂柱现象，小心控制液体出口，使缓冲液刚好降到柱床表面。 2、保持层析柱床表面的完整，上样或加缓冲液时要小心、 缓慢。 3、洗脱时注意记录仪上的蛋白质洗脱峰与收集管之间的对应关系。,恒压高位槽,主要作用：保证整
4、个系统压力的恒定。,HD3紫外检测仪 BSZ-100自动部份收集器LM17型记录仪使用说明,蛋白质自动分析收集系统,HD3紫外检测仪,（监测具有紫外吸收物质的检测仪器 。）,1在仪器使用前，首先检查检测仪、记录仪的电路连接正确，然后接到220V的电源上。2将波长旋钮(在仪器的右侧)旋到所需波长刻度。如蛋白280nm、核酸254nm. 4按下检测仪“电源”开关。如果灯亮，表示光源已开始工作，整台仪器进入工作状态。,操作步骤：,5把“灵敏度”旋钮选择到“100”档，调节“光量”旋钮，检测仪数字显示为100，即透光率为100。 6再把“灵敏度”开关旋到所需档（使用者自行掌握），缓慢调节“调零”旋钮，
5、使记录仪指针在“0”位，检测仪数字显示为“0”。以上步骤需反复调节几次，待层析系统平衡后，即可加样检测。 7.在样品检测过程中，不可再调节“调零”、“光量”旋钮。如绘出的图谱即出峰过小，可改变“灵敏度”选择档，每档成两倍放大关系。,操作步骤：,BSZ-100自动部份收集器,（自动定时收集层析液，从而代替手工操作，提高工作效率 ）,操作步骤：,（1）定位：,A、按“复位”键，仪器自动复位至起点后“报警”，再按“复位”键，仪器自动复位。B、把“安全阀”上“横杆”一头中的硅胶管对准第一根试管中心位置(外圈第一根试管)。对准后固定好各自的固定螺钉。在自动收集过程中，不允许移动硅胶管出口的位置!,（2）
6、设置定时时间,A、按下“手动/自动”键，指示灯不亮，仪器处于“手动”状态。 B、按“选择”键选定设定时间数字的位置，每按一次向后移动一个位置。当数字闪烁时，可通过“置数”键设置该位的时间值，设置顺序从高到低，设置好各位的值后，再按一次“选择”键，此时的数值就是定时时间。(时间单位：分钟),（3）自动收集,A、按“切换”键，“收集”指示灯亮，仪器处于“收集”工作状态。 B、按“手动自动”键，指示灯亮，仪器处于自动收集状态，定时时间在1小时之内，以秒递减至零；定时时间在l24小时之内，以分递减至零，仪器自动转一管，然后重新开始计时。自动收集时，如要检查设置的定时时间，只需按一下“切换“键，就能显示
7、设置的定时时间(显示3秒钟后自动返回)。C、停止收集，可按“手动自动”键，使仪器处于手动状态，或关闭电源开关。,LM17型记录仪,（记录紫外检测仪的信号）,使用方法：,1 1、装上记录纸和记录笔（由教师操作）。2、打电源开关。3、零位调节：按“量程/零位”切换按键，当零位指示灯亮时，数码管显示为“Po”，此时仪器处于零位调节状态。在零位调节状态下，按下“左移”或“右移”按键不放，使记录笔移至所需的零位。,4、 量程选择：按“量程/零位”切换按键，当量程指示灯亮时，表示当前操作为量程选择，数码管显示当前量程范围：V、mV指示当前量程的单位。HD-3紫外检测仪的量程为10mV。 5 取下记录笔的塑
8、料笔套，压下“抬/落笔手柄”（不要强力按压笔尖，以避免笔尖损坏或变粗）。实验结束后，将塑料笔套套上，以避免墨水蒸发。 6 走纸速度选择：按“启/停”切换按键，当纸速显示数码管闪烁时，表示走纸停止，此时按“调速”键调节选择走纸的速度。确定后按“启/停”键，数码管不再闪烁时，仪器即开始记录。（一般为0.2mm/min ）,使用方法：,考马斯亮蓝G-250法检测蛋白质浓度,1按下表配置溶液,蛋白质标准溶液1mg/mL（l ）,蒸馏水（l ）,考马斯亮蓝溶液（ml）,1管,2管,3管,4管,5管,6管,7管,测定管,充分混匀后以1管调零，在595nm处测定各管吸光度。,3,3,3,3,3,3,0.0,
9、100.0样品,80,20,60,100,40,60,80,0.0,20.0,40.0,0,100,3,以浓度为横坐标，吸光度An作纵坐标，做标准曲线。在标准曲线上查出检测管的蛋白质浓度。,制作标准曲线：,1、标准曲线和检测管吸光度的检测应在同样的条件下进行。2、蛋白质浓度过高时，易发生沉淀，故应尽可能在10min内完成检测。,注意事项：,蛋白质垂直板SDS-PAGE电泳,（目的：鉴定蛋白质的纯度、蛋白质的分子量）,聚丙烯凝胶电泳的原理：,浓缩效应,分子筛效应,电荷效应,SDS-聚丙烯凝胶电泳,SDS，带负电荷。破坏蛋白质的氢键、疏水键，形成单个亚基。 SDS-蛋白质的复合物，雪茄形的长椭圆棒
10、 ，所带的负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异。 蛋白质-SDS复合物在凝胶电泳中的迁移率与蛋白质原有电荷和形状无关，而只是蛋白质分子量的函数有关。,试剂：,分离胶缓冲液(1号)：1N HCl 48.0ml与Tris36.3g加蒸馏水到100ml，pH8.9。 单体交联剂(2号)：丙烯酰胺30.0g与甲叉双丙烯酰胺0.8g加蒸馏水到100ml。 催化剂(3号)：10%过硫酸铵(AP)，临用前配制100mg/ml。 加速剂(4号)：四甲基乙二胺(TEMED)1ml加蒸馏水稀释到10ml。,电极缓冲液(6号)：甘氨酸28.8g与Tris6.0g加蒸馏水
11、到100ml，临用前按1：10比例稀释，pH8.3。 上样缓冲溶液(7号)：,固定染色液(9号)：氨基黑10B0.5g，用7%醋酸液稀释到100ml。 漂洗液(10号)：冰醋酸7ml加蒸馏水蒸馏至100ml。,试剂：,凝胶缓冲液配制表,试剂 分离胶溶液（ml） 浓缩胶溶液（ml） 1号 1.60 2号 2.50 1.0 10%SDS 0.10 0.1 蒸馏水 5.70 7.5 5号 1.25 3号 0.05 0.1 4号 0.06 0.06 总体积 10 10 浓度（%） 7 3.0,(1)按分离胶配制表的比例(见前表)，混匀后即成为分离胶溶液。 (2) 吸取分离胶溶液，将其沿玻璃壁缓慢注入凝
12、胶室内，液面高度至玻璃板上端1厘米。注意排出气泡。(此溶液约在一小时内聚合为聚丙烯酰胺凝胶)（3）待浓缩胶聚合后，小心取出梳子，注意千万不要破坏样品槽。上提斜木契板让其松开。取下凝胶密封框。将玻璃胶室凹面朝里置入电泳槽内。插入斜契板。,分离胶的制备：,（3）加样：将电泳液加至内槽凹口以上，外槽电泳液加至平板玻璃上缘3mm处。将样品和上样缓冲液按比例混合，小心地加入样品槽。注意每个样品槽中蛋白质的量应不少于10mg，以利于染色后观察。,盖好电泳槽盖子。正确连接电泳槽与电泳仪的正负极。样品在浓缩胶中电泳时，每块胶以8mA的电流恒流电泳，若两块胶在同一电泳槽同时电泳，电流量加倍。在浓缩胶与分离胶的交界面，蛋白质样品被压缩成一条窄带。当示踪染料进入分离胶后，每块胶的电流增加到18mA.待示踪染料迁移至胶底时，关掉电源，停止电泳。,（4）电泳,将剥出的凝胶浸入9号试剂中泡30分钟，进行固定染色，然后用清水冲洗 掉多余的染料。放入10号试剂中漂洗脱色，在此过程中应经常更换漂洗液，直至背景几乎无色为止，需时约1-2天。脱色后的胶柱放在7醋酸溶液中可长期保存。将凝胶进行拍照，结果留存。,（5）染色及漂洗：,实验记录,实验各操作步骤 实验中观察到的现象 实验结果：记录的图纸；凝胶分析结果,
