1、溶液中蛋白质含量的测定学案【实验分析】应用分光光度计等测试仪器定量测定食物中营养物质的含量，是中学生物实验技术的升级。它不仅让学生感悟到生物学研究技术早就进入科学精准测量时代，而且可以让学生知道自己在课堂中学会的实验技术可以应用到日常生活中，感受学习的乐趣。“溶液中蛋白质含量的测定”是上海市高中生命科学教材第一册中有关蛋白质含量测定的定量实验，也是高中第一个定量的生物学实验。【实验原理】1. 双缩脲反应：双缩脲(NH3CONHCONH3) 是两个分子脲经 180 摄氏度左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与 CuSO4 形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或
2、两个直接连接的肽键，或通过一个中间碳原子相连的肽键的化合物都有双缩脲反应。而蛋白质有两个以上的肽键，因此有双缩脲反应。在碱性溶液中蛋白质与 Cu2+形成紫红色络合物，其颜色深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关。2.标准曲线：定量实验是建立在定性试验的基础之上，需要纯物质作为标准样品。标准曲线法是常用的定量方法，该方法需要配制一组不同浓度的标准溶液，分别测出它们的吸收度，然后以标准浓度（C）为横坐标，以吸收度（A）为纵坐标，即可绘出标准曲线图，曲线为一通过原点的直线。待测溶液亦经过同样处理，测出它的吸收度，即可从标准曲线查出样品的浓度，再由稀释倍数或样品重量求出样品中被测
3、组分的含量。优点：绘制好标准工作曲线后测定工作就变得相当简单，可直接从标准工作曲线上读出含量，因此特别适合于大量样品的分析。缺点：每次样品分析的条件很难完全相同，因此容易出现较大误差。此外，标准工作曲线绘制时，一般使用欲测组分的标准样品（或已知准确含量的样品） ，而实际样品的组成却千差万别，因此必将给测量带来一定的误差，所以要注意实验的重复性问题。3.本实验中将结晶牛血清白蛋白配制成（0 2.5）mg/mL 不同浓度的标准溶液，通过分光光度计或者色度传感器测出它们的吸收度，绘制标准曲线，并通过标准曲线计算待测溶液中的蛋白质含量。【实验目标】1. 知识目标：能概述双缩脲反应的原理，并简要说出标准
4、曲线法的原理和优缺点2. 能力目标：能照使用方法正确使用刻度移液管；能初步使用分光光度计；能利用仪器所测得的数据正确绘制标准曲线，并通过所绘曲线及公式正确计算出待测溶液的蛋白质含量3. 情感态度与价值观：学生能体会到真实记录实验数据和积极、善于分析的科学实验态度和精神，并在日后的实验或学习过程中践行之。【实验材料与器具】1.实验材料：结晶牛血清白蛋白，待测样品（稀释 100-150 倍的鸡蛋清，稀释 100-200 倍的豆浆）2.实验试剂：CuSO45H2O,酒石酸钾钠，10%氢氧化钠，蒸馏水3.实验仪器：分光光度计，试管，试管架，1ml 与 5ml 的刻度移液管，玻璃棒， 250ml 烧杯，
5、10ml 容量瓶，记号笔【实验过程】1. 蛋白标准溶液和双缩脲试剂的配置：称取结晶牛血清白蛋白 25mg，溶解于蒸馏水并定容至 10ml，制成 2.5mg/ml 浓度的牛血清白蛋白标准溶液；0.75g 五水硫酸铜（CuSO45H2O）和 3.0g 酒石酸钾钠，用 250ml 蒸馏水溶解，在搅拌下加入 150ml 氢氧化钠溶液，用水稀释到 500ml 即得双缩脲试剂，可长期储存于塑料瓶或内涂有石蜡的试剂瓶中。2取 7 支试管，从 0 依次编号。3按照下表在试管 0-5 中加入牛血清白蛋白标准液及蒸馏水，在试管 6 中加入待测液1ml。4每只试管加入 4ml 双缩脲试剂。5静置 20min，以蒸馏
6、水为空白对照，在 540nm 波长下测定各试管中样品的吸光强度，记录 O.D 值。6以 O.D 值为纵坐标，蛋白质含量为横坐标绘制标准曲线。7根据试管 6 测得的 O.D 值，从标准曲线中查出其中的蛋白质含量。8蛋白质含量的计算：蛋白质含量（mg/ml）=D*N 。D-从标准曲线上查出的蛋白质含量；N-稀释倍数。【实验说明】1. 安排：鉴于时间与空间的关系，届时每组派一名同学共 4 名完成标准曲线的实验（0-5号试管溶液的添加） ，并用 excel 制作标准曲线；其余每组同学可根据自己的需要选择不同稀释浓度（100-150 之间）的鸡蛋清或豆浆（有兴趣的同学当天可自带材料探索，如牛奶等） 。2
7、. 注意事项：1） 使用分光光度计时，请务必确认是在 540nm 下，使用中轻拿轻放，爱护实验仪器；每只试管重复测三次2） 因待测蛋白质稀释溶液需在 0.25-2.5mg 之间，自带材料浓度未知的届时需稀释多个梯度浓度以确定合适的可测范围，本组提供的材料是经过多次实验探索到的可测蛋白质含量的稀释浓度，请放心使用3） 操作过程务必严谨，稍不注意易导致实验失败。3知识拓展：1）经前人实验的不断探究，添加酒石酸钾钠配置的双缩脲试剂不仅较“先加 5%NaOH后加 1%CuSO4”更能增强实验的灵敏度和结果的稳定性，且其可以在塑料瓶或内涂有石蜡的试剂瓶中长期储存。2）随着科技的发展，蛋白质测定方法的研究
8、取得较大进步，有多种其比较如下表：方法 灵敏度 时间 原理 说明凯氏定氮法 较低，适用于0.2-1.0mg费时，8-10h 将蛋白质转化为氮，用酸吸收后滴定用于标准蛋白质含量的准确测定，干扰少，费时太长双缩脲试法 较低，适用于 1- 中速，8-10h 多肽键+碱性 用于快速测定，20mg Cu2紫色络合物但不太灵敏；不同蛋白质显色相似紫外吸收法 较为灵敏 ，50-100ug快速，5-10min 蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在 280nm 处的光吸收用于层析柱流出液的检测；核酸的吸收可以校正考马斯亮蓝法 灵敏度最高，1-5ug快速，5-10min 考马斯亮蓝燃料与蛋白质结合时，max465nm
9、变为595nm最好的方法，干扰物质少，颜色稳定：颜色深浅岁蛋白质不同而变化参考文献：郭颖娜，孙卫.蛋白质含量测定方法的比较.河北化工.2008,31(4):37【实验结果记录】1. 标准曲线记录管号 0 1 2 3 4 5第一次 OD第二次 OD第三次 OD平均值 OD2. 实验记录物质 组别 OD 平均 OD 值 浓度12豆浆 100*312豆浆 200*312鸡蛋 100*312鸡蛋 150*3【附录】我们预实验的各管号 O.D 值与标准曲线如下：管号 0 1 2 3 4 5第一次 0.035 0.056 0.076 0.097 0.112 0.135 第二次 0.035 0.057 0.076 0.097 0.112 0.135 第三次 0.035 0.056 0.076 0.097 0.113 0.135 平均值 0.035 0.056 0.076 0.097 0.112 0.135 待测豆浆与鸡蛋清蛋白质含量：物质 OD 浓度豆浆 100* 0.093 1.949616368豆浆 200* 0.058 1.054475703鸡蛋 100* 0.083 1.693861893鸡蛋 150* 0.089 1.847314578
