1、龙志敏 200930220121 09制药一班实验二 绿豆芽的蛋白质含量测定 (考马斯亮蓝G-250 比色法 ) 一、实验目的 1、了解考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的原理，掌握其测定方法。 2、熟练掌握分光光度计的使用技术。 二、实验原理 考马斯亮蓝G-250是一种染料，在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为蓝色，该结合物在595nm波长下有最大光吸收。在一定的蛋白质浓度范围内(01000g/mL)，其吸光度与蛋白质含量成正比，故可用于可溶性蛋白质的定量测定。 三、仪器、试剂和材料 1、仪器设备 分析天平、10mL塑料离心管、5mL 移液管、研钵、量筒、50mL 离心管、10mL容量瓶、离心
2、机、722型分光光度计 2、试剂 （1）标准蛋白质原液：称取100mg 牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100mL，即为1mg/mL的标准蛋白质原液。 （2）考马斯亮蓝G-250试剂：称取 100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL 95%乙醇中，加入 85%（m/v）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL。此溶液在常温下可放置一个月。 3、材料： 绿豆芽 四、操作步骤 （一）绿豆芽蛋白质样品的制备 1、准确称取新鲜绿豆芽下胚轴2g，放入研钵中，加入2mL蒸馏水研成匀浆，转移至50mL 离心管中，再用6mL蒸馏水充分洗涤研钵，洗涤液收集于同一量筒中，定容至10ml,混匀； 2、冰浴
3、中放置10-20 min以充分提取； 3、从量筒中取1ml至离心管，12000rpm离心5min，将上清液倒入10mL 量筒，以蒸馏水定容至10mL，即得绿豆芽蛋白质样品溶液。 （二）标准曲线制作 2、高浓度标准曲线的制作（01000g/mL） 取6 支1.5mL 的离心管，按表1.2 加入试剂，配制不同浓度的蛋白质标准液 试管号 0 1 2 3 4 5 1mg/mL 的标准蛋白质原液(mL) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水(mL) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 蛋白质含量(g) 0 200 400 600 800 1000 OD595nm 0 0.196 0
4、. 346 0.487 0.602 0.781另取6 支10 mL 的离心管，编号标记，从上述各管中分别吸取0.1mL 溶液，加入5 mL 考马斯亮蓝G-250 试剂，盖上离心管盖子，充分混匀，放置3min 后在595 nm 波长下比色测定（比色应在 l h 内完成），记录各管测定的光密度值OD 595nm。以牛血清白蛋白含量（g）为横坐标，以吸光度为纵坐标，制作蛋白质浓度为01000g/mL的标准曲线如下：高 浓 度 标 准 曲 线00.1960.3460.4870.6020.781y = 0.0008x00.10.20.30.40.50.60.70.80.90 200 400 600 80
5、0 1000 1200血 清 白 蛋 白 含 量 （ g）吸光度（595nm）吸 光 度线 性 (吸 光 度 )（三）绿豆芽蛋白质样品溶液浓度的测定 另取2 支10 mL 的离心管，分别加入0.l mL 绿豆芽蛋白质样品溶液，加入5 mL 考马斯亮蓝G-250 试剂，盖上离心管盖子，充分混匀，放置 3min 后在595 nm 波长下比色，记录吸光度，如下表：试管号 1 2 绿豆芽蛋白质样品溶液（ml）0.1 0.1OD595nm 0.224 0.235计算吸光度平均值得：（0.224+0.235）/2=0.229五、结果与分析 所测样品提取液的吸光度为0.229，代进标准曲线方程：Y=0.00
6、08X得其相应的蛋白质含量为286.25g计算绿豆芽蛋白质含量=14.3g六、注意事项 1、蛋白质和考马斯亮蓝G-250结合的反应迅速，反应在2 min左右达到平衡，其结合物在室温下1h内保持稳定。因此，比色应在出现蓝色3 min l h内完成，不可放置太久。 2、考马斯亮蓝染色能力强，所用比色皿应及时清洗，否则会污染比色皿，影响吸光值测定。切不可使用石英比色皿测定。 3、高浓度的Tris 、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵和去污剂对测定有干扰。七、思考题 1、做好本实验的关键问题有哪些？答：研磨绿豆芽要充分；冰愈离心时间要足；比色应在出现蓝色3 min l h内完成2、如何正确使用分
7、光光度计？答：1 .接 通 电 源 ， 打 开 仪 器 开 关 ， 掀 开 样 品 室 暗 箱 盖 ， 预 热 10 分 钟 。 2.将 灵 敏 度 开 关 调 至 “1”档 （ 若 零 点 调 节 器 调 不 到 “0”时 ， 需 选 用较 高 档 。 ） 3.根 据 所 需 波 长 转 动 波 长 选 择 钮 。 4.将 空 白 液 及 测 定 液 分 别 倒 入 比 色 杯 3/4 处 ， 用 擦 镜 纸 擦 清 外 壁 ， 放入 样 品 室 内 ， 使 空 白 管 对 准 光 路 。 5.在 暗 箱 盖 开 启 状 态 下 调 节 零 点 调 节 器 ， 使 读 数 盘 指 针 指 向 t=0 处 。 6.盖 上 暗 箱 盖 ， 调 节 “100”调 节 器 ， 使 空 白 管 的 t=100， 指 针 稳 定 后逐 步 拉 出 样 品 滑 竿 ， 分 别 读 出 测 定 管 的 光 密 度 值 ， 并 记 录 。 7.比 色 完 毕 ， 关 上 电 源 ， 取 出 比 色 皿 洗 净 ， 样 品 室 用 软 布 或 软 纸 擦 净 。
