生物实验室操作规范.doc

1、生物实验室操作规范第 1 章 生物实验室规范1. 进入实验室需要在实验室使用登记簿上登记，没有经过培训的人员不允许单独进入细胞间；2. 进第二间屋子换上门口拖鞋，外套脱下，换上白大褂；3. 进细胞间，换上拖鞋，并换上相应的白大褂；4. 放在实验室的任何化学药品需要贴上标签，写明试剂名称、联系方式，否则一律垃圾处理；5. 放入细胞间的物品需用酒精擦拭外包装。放入冰箱的物品外围需用酒精擦拭，然后注明试剂名称、使用者，远离培养基；6. 有毒、易挥发试剂在外间通风柜内操作；7. 双手接触过任何未灭菌的东西后，都需用酒精消毒后才能接触灭菌的器具或试剂； 8. 值班同学：晚上开紫外灯，早上关掉；垃圾箱满了

2、倒掉；废液瓶满了，加入次氯酸钠后倒掉；所有的仪器是否关闭；试剂是否收好；衣服、鞋子是否摆好。第 2 章 生物实验室间使用要求2.1 实验前的例行检查与消毒措施1. 减压阀检查：减压阀是连接在 CO2 培养箱与 CO2 气瓶间的减压装置，用于将气瓶内较高的压力降低至培养箱可以使用的压力。靠近气瓶的一级压力表盘指示气瓶内气体压力，当该压力小于 1.5MPa 时，表明 CO2 气体不足，应及时购买气体 1。远离气瓶的二级压力表盘指针应在 0.02-0.04MPa 之间，若超出此范围请根据箭头指示调节旋钮（注意：a 旋钮感觉越紧，阀门开口越大；b 指针示数会因为培养箱对橡胶管内气体的间断吸气而跳动，调

3、节旋钮时注意延时因素，并将跳动范围控制到 0.02-0.04MPa 间） 。2. CO2 培养箱检查：温度显示应在 36.9-37.1（）之间，CO 2 浓度在 4.9-5.1（%）之间， 严禁私自改变设置 。底部增湿盘中水量不足 1/3，应及时添加无菌去离子水， 严禁添加自来水 。培养箱长时间断电重启后，应仅设置温度为 37，CO 2 浓度设置为零，待培养箱温度稳定在 37六小时后，再设置 CO2 浓度为 5%。3. 医用冰箱检查：医用冰箱在稳定状态下冷藏温度应为 4，冷冻温度应为-20，若示数变化应及时联系管理员。4. 例行消毒：a. 在房间无人状态下，每周打开紫外消毒灯 30 分钟至少

4、2 次；b. 实验前后，用 已经被 70%酒精浸湿 的纸巾擦拭生物安全柜操作台；c. 实验前后，分别打开生物安全柜内的紫外灭菌灯至少 30 分钟；d. CO2 培养箱底盘去离子水 两周 更换一次，每次添加 0.1%的新洁尔灭溶液；e. 每四周 清洗一次 CO2 培养箱，将托盘、水盘等拆卸，并用 70%酒精对培养箱内部箱体及零件全部擦拭一遍；f. 每两周 用次氯酸钠漂白水稀释液清洗实验室地面；g. 平时应随手用酒精擦拭桌面，保证桌面整洁。水浴锅内应及时添加或更换去离子水，视具体情况而定。2.2 相关厂家联系方式1. CO2 气瓶：纯度规格三个九，千禧京城，http:/ 1000 元左右，有空瓶后

5、可以充气，约二百元；2. CO2 维修保养：见培养箱箱体；3. 移液器与电动移液枪维修：北京龙跃伟逸科贸，13301170466，15811173739；4. 生物安全柜维修：青岛海尔特种电器有限公司，4006992008；5. 医用冰箱维修：青岛海尔特种电器有限公司，4006992008；6. 离心机：江苏省金坛市医疗仪器厂，0519-82532542 ，82531618。第 3 章 细胞间操作规范1. 实验操作必须更换实验区拖鞋，穿着白大褂，佩戴无菌手套，应勤用酒精对前臂及双手消毒；2. CO2 培养箱内部环境非常适宜微生物繁殖，故所有从外界拿入培养箱内的物品均需要用 70%酒精提前擦拭消

6、毒，在对培养箱操作之前务必对双手及前臂消毒；3. 所有将要使用或用过的 试剂及容器 务必立即标注使用人的 姓名首字母、日期、试剂名称或状态 以防其他实验人员混用或误认为是干净的无菌容器而造成污染；4. 一般情况下 不允许 拿出生物安全柜内器械，若必须在安全柜外使用器械，则应在使用后经 70%酒精仔细擦拭消毒后放回安全柜内；5. 安全柜的无菌气流由上自下吹过，并在操作台表面分成前后两股气流进入循环系统，故应 尽可能避免不干净的物品（如双手、使用过的耗材等）出现在无菌物品上方 ，操作应尽量在安全柜中间部分进行，尤其 不能置无菌耗材于前风幕与外界环境的交界处 ；6. 锥形瓶中的生物废液可在加入适量次

7、氯酸钠漂白液消毒后，倒入下水道中，洗净瓶体后加入厚约 1cm 的次氯酸钠漂白液继续盛装生物废液。使用、污染过的生物耗材应置于次氯酸钠漂白液消毒后再作为一般垃圾处理；7. 使用移液枪及电动移液器时应慢速、小心操作，避免液体接触枪体，若不慎接触，应立即用 70%酒精擦拭消毒。对于电动移液器，过度吸取液体会堵塞器械管口，可能造成仪器失效，若更换枪体内过滤器后仍不能正常使用，需联系厂家维修；8. 实验结束后，清理废液烧杯，并用酒精擦拭安全柜台面，当电动移液器电量不足一半时，应及时充电，避免电池老化，开启紫外灯至少 30 分钟。务必仔细检查使用过的仪器、器材，确定离心机电源关闭，水浴锅锅盖改好，显微镜已

8、关闭，最后应清理桌面，保持实验室整洁干净，垃圾桶快满时注意将垃圾带走并换上新的垃圾袋；9. 酒精喷壶、酒精灯中酒精快用完时，注意及时补充，尤其是酒精灯。第 4 章 细胞培养4.1 细胞培养注意事项1. 打开生物安全柜紫外灯消毒 30 分钟以上，开启安全柜前玻璃面板，至少运行风机 10 分钟以上，保证气流稳定；2. 提前将培养液置于 37水浴锅加热（注意不要被紫外线照射以防破坏营养成分） 。若旧培养液耗尽，则应立即在新培养液的容器上标注使用人的姓名；加热时间不宜过长，达到室温即可；3. 对双手消毒后打开培养箱，将培养瓶瓶盖旋紧后取出样品并放入安全柜，标记传代次数，将加热至室温的培养液取出，并用酒

9、精擦拭消毒（注意不要擦拭有字区域）后放入安全柜。4.2 培养液成分1. HL-60 细胞所采用的全培养基成分为 89%RPMI-1640、10% FBS 和 1% 双抗（青霉素/链霉素） ；2. HeLa 细胞所采用的全培养基成分为 84%DMEM、15% FBS 和 1% 双抗（青霉素/链霉素） 。4.3 细胞复苏1. 将细胞从液氮中的冻存盒取出，用镊子夹着冻存管置于 37水浴中，不停晃动冻存管（尽量避免冻存管封口处浸入水中，以防细胞被污染） ，使其快速完全融化，得到细胞悬浮液；2. 用移液枪将细胞悬浮液吸出放入离心管中 1.5ml，15ml 离心管都行，用15ml 多加培养液，可将 DMS

10、O 去除更干净） ，加入适量（的培养液并混匀，然后进行离心去除悬浮液中的 DMSO，设定离心转速 800r/min 左右，离心4 分钟左右；3. 弃去离心管中上层含 DMSO 的冻存液，一般加入新培养基 45ml（根据培养瓶和或培养皿的容积确定） ，混匀，然后移入培养容器中。注意：如果细胞存活率不高，可尝试先加入适量新培养液直接培养，一天后再换新培养液，根据实验结果来看，刚解冻细胞对离心较敏感。4.4 细胞传代4.4.1 悬浮细胞传代1. 用 5mL 移液枪吸走 4/5 的细胞悬浮液（大约为 4ml） ；2. 换新枪头，加入与吸走悬液相同量的新培养液；3. 用移液枪混匀，放入培养箱；注意：如果

11、需要精确传代，则需对细胞悬液进行计数，然后保留所需数目的细胞进行培养。4.4.2 贴壁细胞传代1. 用旧液体轻轻冲洗培养瓶底，然后用移液器枪吸尽旧培养液（弃去） ；2. 加入 2ml 左右 PBS，轻轻摇晃，然后同样用移液枪吸掉 PBS（用 PBS 是为清洗掉旧培养液中的血清，因为血清可抑制胰酶的活性，后面也是采用含血清新培养液终止胰酶消化的） ；3. 加入约 0.6ml1ml 胰酶（为常规 5ml 的培养瓶和 5ml 培养皿的用量，没有明确限制，只奥胰酶能润湿所有细胞即可） ，室温或放置 45 分钟，培养箱中放置 12 分钟（放置于显微镜下观察，细胞变圆时就可以终止消化） ；4. 加入约 1

12、ml2ml 培养基（含有小牛血清）终止消化；5. (a) 如终止消化后，大部分细胞还贴壁，则可直接吸走胰酶和培养液的混合物，然后加入适量新培养液，然后将细胞和培养液混合均匀，取适量到新培养瓶/皿中，继续培养。(b) 如终止消化后，大部分细胞已脱落到胰酶和培养液的混合液中，则需进一步将细胞吹离瓶壁，混合均匀，然后取适量细胞悬到离心管中进行离心800 1000r/min，53 分钟，然后离心管中上清液去除，加入新培养液，将细胞吹打重悬。取适量到新培养瓶/皿中，继续培养；6. 传代结束后，对双手、前臂及培养瓶消毒后，将培养瓶置于培养箱内并旋松瓶盖，确保培养瓶透气。4.5 细胞冻存1. 重复细胞传代中

13、消化细胞的步骤，将细胞通过胰酶消化下来，同样加入适量含 FBS 的培养液终止胰酶消化，然后用移液枪将细胞转移至离心管，设定离心机转速 1000r/min 左右，离心 3 分钟左右，去除上层培养液，留下底部白色细胞团；2. 细胞团中加入冻存液（90% 完全培养液+10%DMSO，较敏感细胞可用90%FBS +10%DMSO。加 DMSO 是为防止细胞被冰晶刺破，用 FBS 取代完全培养液是为减少水分） ，用移液枪轻轻吹打制成细胞悬液；3. 分转到冻存管内，1.8ml 的冻存管每个可加入 1.2 至 1.5ml，将冻存管口封严，贴上标签，注明冻存时间、细胞种类及代数；4. 按下列顺序降温，并最终冻

14、存：室温、4 冰箱放置 30min 、 -20冰箱放置 2h 、-70冰箱过夜（我们无此温度冰箱，放在液氮表面 8h 至 16h 代替）、投入液氮。注意：准备冻存的细胞，最好是对数期生长的细胞，一般取细胞铺满底部 70%左右时可消化冻存，等细胞铺满底部时，细胞通常不是最佳状态。悬浮细胞可在常规换液前几小时操作。第 5 章 主要设备操作说明5.1 安全柜使用说明1. 向上推动打开玻璃窗（不要超过面表上标记的刻度） ；2. 大概 2 分钟后风速稳定（控制面板上风速不变化） ，再进行操作，如果在打开玻璃窗之前紫外灯是打开的，则最好多等几分钟，以使紫外光产生的臭氧被排出；3. 实验操作完成后，用酒精擦

15、拭台面；4. 关闭玻璃窗，设定紫外灯开启时间。注意：实验操作过程中，如果袖子或其它物体遮住过滤网，安全柜会警告风速不稳定，尽量避免出现这种情况。进一步详细操作可参考安全柜说明书。5.2 培养箱使用说明1. 打开培养箱之前现在手上和门把手处喷上酒精；操作时不要和周围的人交谈以防口中细菌进入培养箱；2. 断电后，待温度上升到 37 度，再设定二氧化碳的浓度为 5%，否则二氧化碳传感器不准确。进一步详细操作见培养箱说明书。5.3 显微镜使用说明每次使用的开始和结束时间需精确登记，尤其是关闭汞灯的时刻，具体的使用操作见显微镜使用说明。操作步骤如下：一、 明场观察1接通电源线，打开电源开关（“”为开，

16、“”为关） ，同时按下显微镜前面的按纽（有灯泡） ；2用光路选择杆选择“观察”光路（有眼睛图形） ，选择所需放大倍数的物镜，并将选择环置于相应的位置，使用光调节旋钮和滤光片，调节至适当亮度；3将标本放在载物台上，转动粗微调调节视野内图象清晰；4调节目镜使观察舒适；5如需拍照，则打开电脑，选择所需软件，将光路杆调至“旁路光口”（有相机图形） ，即可拍摄并保存；6使用完毕后，关闭主开关（至 O） ，取下电源插头。二、 DIC 观察1. 打开明场电源开关（“”为开， “”为关） ；2. 将样品置于载物台上，用样品夹夹好；3. 将起偏器、检偏器、DIC 棱镜推入光路，荧光滤块转盘拨到“1”位置，DIC

17、 棱镜应与相应的物镜倍数相匹配；4. 先选用低倍物镜（“ 10”） ；5. 调节透射光的强度，调节焦距，找到视野；6. 换到高倍镜头，观察样品，DIC 观察时，光路选择拉杆拉到中间位置，既可观察，也可拍照。三、 荧光观察1. 如使用荧光，打开荧光光源，此时最好关闭明场光源。将荧光光路shutter 打开（ “”为开， “”为关） ，需保护样品时关闭 shutter；2. 选择所需波段的荧光，并用荧光调节杆调节亮度；3. 从低倍镜开始观察，调焦，找到预观察视野，依次换到高倍镜头，观察样品；4. 不观察时，要及时使用光栅切断荧光（关，开） ，避免样品荧光衰减，如荧光较暗，将周围光亮度减至最低（关灯

18、，拉上窗帘） ；5. 拍摄步骤同普通明场观察。四、 软件功能简介1. 图像叠加、自动定时拍摄（ISO=200 时比较清晰） ；2. 比例尺设定（可设定标尺的参数） ；3. 可调节背景光颜色以达到白平衡，从而得到真实标本颜色；4. 调节曝光时间可改变得到图像的亮暗程度。注意事项1. 光纤不能大角度弯曲以免折损；2. 在使用完毕关机时,将镜体电压调至最低 , 即保证光的强度最弱才可关闭电源，防止重新开机时电压高而烧坏灯炮；3. 不要频繁开关电源;为了延长汞灯使用寿命,请在打开电源后 15 分钟之内不要关电源,第二次重新开机间隔时间最少 10 分钟; 同时建议汞灯每次使用不超过 2 小时；4. 电脑

19、主机机箱后面插着的类似 U 盘的器件，不要拔掉（那不是 U 盘！） ；5. 对于光源的控制也要注意，转动光强调节钮时切忌小心，不可太过，以防损坏；6. 使用完毕后一定要将物镜置于载物台下方，保持清洁。这一步可以通过转动三孔转换器实现；不要随意拆散物镜；7. 对目镜、物镜、聚光镜等光学部件的表面有灰尘时,应先用吹气球吹,再用棉签蘸清洁液擦拭,方法是由内向外螺旋型擦拭，清洁液建议使用 70%乙醚和 30%无水酒精混合液；同时注意不要随意擦拭荧光激发块；8. 将镜头转到低倍镜，取出样品，若使用过油镜用干净的擦镜纸擦拭镜头；9. 载玻片不同厚度时，需要转动物镜上的校正环才能得到最清晰图像。5.4 灭菌

20、锅使用说明1. 打开电源按钮（前面板右上方） ；2. 一手按住顶盖靠身体处（有手型标志） ，然后另一手将前面板左上方的开关拨到右上方，此时顶盖打开；3. 检查灭菌锅水位是否处于底部中央大孔和周围 8 个小孔之间。如果低于大孔，则需要加水，可将灭菌锅自带冷凝壶中的水倒入（注：冷凝壶中的水位要保持在 LOW 与 HIGH 之间） ，也可加入纯净水和去离子水，不要用自来水，以免产生水垢；如果处于大孔和小孔之间，则可将需灭菌器材用纱布包好放入到金属框中（一定要放入金属框中） ，置于灭菌锅中灭菌。对瓶装水灭菌时，注意将瓶盖拧松，让水蒸气排放通畅，以免爆炸；4. 盖好顶盖，打开顶盖左下方控制面板的控制程序

21、开关，灭菌时参数为：灭菌温度 120 度，灭菌时间 20 到 40 分钟，灭菌结束后保温温度为 60 度（保温温度没有明确要求） 。灭菌中途，可按控制面板的 stop 键强制停止，强制停止后打开盖子前，请注意显示器中显示灭菌锅中的温度和压强，以防烫伤；5. 灭菌结束及时取出被灭菌器材，然后放入干燥箱中，关闭电源按钮（灭菌锅进一步操作说明，去查阅产家说明书） 。5.5 干燥箱使用说明1. 打开左侧面左下角的电源按钮；2. 按箱体前侧左下方控制面板的 Call 按钮，然后上下键设定参数（主要设定干燥温度 80，干燥时间已设定 48 小时后自动关闭，有些不需要干燥 48 小时，如急用的话，干燥后直接取出就行。参数一般按默认即可） ；3. 按 Start 按钮，开始升温干燥。5.6 电子天平使用说明开机后注意预热 20 分钟，否则可能称量结果不准确。