1、1第三章 分子克隆载体3.1 质粒载体质粒是独立于寄主染色体以外的自主复制的共价、闭合、环形的双链 DNA 分子(covalently closed circular DNA, cccDNA)。除了酵母的杀伤质粒(Killer plasmid)是 RNA 质粒外，所有的质粒都是 DNA。但是质粒 DNA 的复制又必须依赖于寄主提供核酸酶及蛋白质。质粒 DNA 分子大小 ：小的仅有 103KD，仅能编码 2-3 种蛋白质；大的可达 105KD，两者相差上百倍。质粒 DNA 与寄主染色体 DNA 间的关系：一般情况下，质粒 DNA 可持续地处于寄主染色体外的游离状态，但在一定条件下又可以可逆地整合
2、到寄主染色体上，并随之一道复制和细胞分裂而传到后代。一、质粒的一般特征1.质粒 DNA 编码的表型质粒 DNA 的分子量较小，仅占细胞染色体的一小部分，一般约为 3%，但却编码着重要的遗传性状：a.抗性特征：抗菌素抗性、重金属抗性、毒性阴离子抗性，以及其它抗性。b.代谢特征：抗菌素及细菌素合成；简单的碳水化合物(例如乳糖、蔗糖等) 的新陈代谢；复杂碳水化合物(甲苯、苯胺)及卤代化合物的新陈代谢；蛋白质新陈代谢； c.修饰寄主生活方式的因子：大肠杆菌肠毒素的合成；金黄色葡萄球菌剥脱性毒素的合成；2.质粒 DNA 的转移 接合型质粒和非接合型质粒*接合型质粒(conjugative plasmid
3、)：又叫自我转移质粒，具有自我复制基因。控制细菌配对和质粒接合转移的基因；*非接合型质粒(non- conjugative plasmid)：亦叫不能自我转移的质粒，具有自我复制基因，但失去了控制细胞配对和接合转移的基因，因此不能够从一个细胞转移到另一个细胞。质粒 DNA 的转移过程 质粒自主转移质粒的辅助转移质粒的重组转移 3.质粒 DNA 的复制类型2根据寄主细胞中所含拷贝数的多少，讲质粒分为：低拷贝数质粒“严紧型”控制的质粒(stringent plasmid)：每个寄主细胞中仅含有1-3 份拷贝；高拷贝数质粒“松弛型”复制控制的质粒(relaxed plasmid)：每个寄主细胞中可高
4、达10-60 份拷贝。一种质粒究竟是属于严紧型还是松弛型并非绝对的，它的复制不仅受自身的制约而且还受到寄主的控制4.质粒的不亲和性 定义：是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一寄主细胞中稳定共存的现象。注意：只有当有确切的证据表明第二种质粒 B 已经进入含有 A 质粒的寄主细胞，而且它的DNA 不受寄主细胞限制体系的降解作用，但这两种细胞却不能长期共存，只有在这种情况下，我们才能说 A 和 B 是不亲和的质粒。不亲和群的概念：彼此之间互不相容的质粒，属于同一不亲和群(incompatibility group)。彼此能够共存的质粒则属于不同的不亲和群。同一不亲和群
5、的南粒在亲缘关系上则比较接近，以大肠杆菌的质粒为例：ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不亲和pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不亲和p15A 及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不亲和质粒不亲和性的分子基础质粒不亲和性的分子基础，主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的：*. 负反馈调节环(negetive feed-back loop)：大多数质粒产生可控制质粒复制的阻遏蛋白质，其数量与细胞中质粒拷贝数成正比。当质粒面临高拷贝数和高浓度的阻遏蛋白时，其复制活动便被抑制了。当质粒处于低拷贝数和低浓度的阻遏蛋白时，其复制活动更会继续时行。.同一个细胞含两种相
6、容质粒，由于亲缘关系远，故它们所产生的阻遏蛋白质就不会互相影响另一个质粒的复制。于是这两种质粒在同一细胞中都保持着自己的正常拷贝数。*.同一细胞含两种不相容的质粒，亲缘关系密切，它们所产生的阻遏蛋白质不仅影响自身质粒 DNA 复制，还会彼此影响对方质粒 DNA 的复制。这就出现了两种阻遏蛋白质联合调控质粒复制速率。*两种不相容质粒往往拷贝数不相当，其中高拷贝数的对复制抑制剂的敏感性较低拷贝数的要差一些。因此在复制抑制剂(阻遏蛋白质) 浓度低的情况下，高拷贝质粒仍可复制，从而最终使低拷贝质粒被淘汰掉(稀释掉) 。3二、质粒 DNA 的复制与拷贝数的控制 1ColE1 质粒 DNA 复制调节的机理
7、许多的质粒载体都是由 ColE1 质粒派生的。 ColE1 质粒的复制是从一个特定的复制起点（ori）开始，并沿着环型 DNA 单向进行。RNAI 和 RNAII 这两种分子都是由 ColE1 DNA转录产生的，是控制 ColE1 质粒复制的两种关键因素。由于这两种 RNA 分子是根据同一区段 DNA 的正反链合成的，因此两者的序列是彼此互补的。RNAI 是由 ColE1 质粒的 inc基因编码的一种小分子量的 RNA 分子，它通过干扰 RNAII 分子的加工而抑制质粒 DNA分子的复制。RNAII 也是由 ColE 质粒 DNA 编码的另一种小分子量的 RNA 分子，并在复制起点形成 RNA
8、-DNA 杂交分子。RNase 是一种核酸内切酶，它切割 RNAII 分子释放出3-OH 作为 DNA 聚合酶 I 催化的 DNA 复制的引物。所以控制 ColE1 质粒复制的关键点就是在复制起点形成 RNA-DNA 双链分子，而它的关键步骤却是由 RNA控制。ColE1 的复制同样也受一种 RNA 调节剂 Rom 的控制，它可以使 RNAI 和 RNAIIII 之间的碱基配对作用保持稳定，从而阻止 RNA 与模板 DNA 杂交2质粒复制控制的分子模型目前公认的阐明质粒复制控制机理的分子模型有两个:自体阻遏蛋白质模型:核心是阻遏蛋白质的合成受负反馈调节机理调节。关键论点是：阻遏蛋白质的合成受负
9、反馈机理调节，而且其浓度是恒定的。 抑制蛋白质稀释模型:阻遏蛋白质是组成型合成 ,其浓度同质粒的拷贝数成正比。关键论点是：阻遏蛋白质是组成型合成，其浓度同质粒的拷贝数成正比。抑制蛋白质稀释模型质粒 DNA 的复制是受一种由质粒编码的抑制蛋白 Cop 调控的。Cop 蛋白质的浓度同质粒的拷贝数成正比。它通过两种途径质粒的复制：一种是通过同质粒 DNA 的复制起点(ori)结合，直接抑制质粒复制.另一种是通过阻断起始蛋白质 Rep 的合成，间接地抑制质粒 DNA的合成。一般认为,单体状态的 Cop 蛋白质是没有活性的，当处于多体状态时，才具有活性，而这两种蛋白之间的平衡,取决于细胞中抑制蛋白质自身
10、的浓度。由于细胞在生长过程中体积不断增大，蛋白浓度下降,形成单体形式，失去抑制作用，质粒拷贝数增加。但由于拷贝数增加抑制蛋白编码基因数目也随之增加到一定程度又导致质粒复制受抑制。自体阻遏蛋白质模型质粒的复制是由起始蛋白 Rep 引发的,该蛋白是复制启动作用的限速因子.它的浓度决定着每个细胞每个世代的质粒的最终复制总数. Rep 蛋白编码基因 rep 和自体阻遏蛋白质编码基因 atr 是属于同一个操纵子,共转录成同一个 mRNA 分子.自体阻遏蛋白同启动子-操纵子区(P/O)的结合作用,调节质粒的转录 ,以维持细胞中 Atr 和 Rep 蛋白处于恒定的水平.,而由 Atr蛋白调节产生的 Rep
11、蛋白,则是通过同复制起点(ori)的结合来引发质粒复制 .另一种解释是 Rep 蛋白具有双重功能,既具有自体阻遏蛋白的功能,也可同(P/O)的结合抑制转录,又具有起始蛋白功能,引发质粒复制.4三、质粒 DNA 的分离与纯化1氯化铯密度梯度离心法原理：由于质粒 DNA 与染色体 DNA 在化学结构上并没有什么差别，因此，要使质粒DNA 与其寄主染色体 DNA 区分开来，就必须从两者 DNA 的高级结构上寻找突破口。实验表明，在细胞裂解和 DNA 的分离过程中，大分子量的细胞染色体 DNA 容易断裂成相应的线性片段，而质粒 DNA 由于分子量小，结构紧密，因此仍能保持完整的状态。氯化铯-EtBr
12、密度梯度离心法，就是根据这种寄主染色体 DNA 与质粒 DNA 在高级结构上的差别(或说是异质性)而分离纯化的技术。在氯化铯密度梯度离心中，氯化铯是作为介质其密度为 1.7g/cm3，经过一段超速离心平衡之后，便形成了 1-1.9052g/cm3 的连续的浮力密度梯度。已知大肠杆菌寄主染色体 DNA、质粒 DNA、大肠杆菌寄主染色体 DNA 和 RNA 等 4种大分子物质，具有不同的浮力密度，因此经过超离心平衡之后，便会分布在 CsCl 连续密度梯度介质的等密度位置上，从而达到了彼此分离的目的。缺陷：尽管氯化铯-EtBr 密度梯度离心法可以得到高纯度高质量的质粒 DNA，但是操作复杂，且需要昂
13、贵的氯化铯和超离心设备，并且溴化乙锭又是极强的致癌物质。所以目前最流行的分离纯化质粒 DNA 地方法是碱变性法。 2.碱变性法原理：是基于染色体 DNA 与质粒 DNA 的变性与复性的差异而达到分离目的。在 pH 高达12.6 的碱性条件下，染色体 DNA 的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒 DNA 的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当通过致冷或恢复中性 pH 值，变性的质粒 DNA 又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体 DNA 不能准确复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体 DNA 与不稳定的大分子 RNA、蛋白质-SDS 复合物等一起沉淀下来而被
14、除去。 四、质粒载体的构建及其类型 质粒载体必须具备的条件a.具有复制起点：这是质粒增殖所必不可少的条件，亦可帮助维持正常的质粒拷贝数b.具有抗菌素抗性基因：提供转化子的选择记号，理想的质粒载体应具两个抗菌素抗性基因。在外源 DNA 插入之后，仍应保留一个强选择记号。c.具有若干种限制酶单一识别位点：这一特点可满足克隆需求，而且要求在插入了外源DNA 片段之后，应不影响质粒 DNA 的复制功能。d.具有较小的分子量和较高的拷贝数：易于操作，而且在插入了外源 DNA(一般不超过15Kb)仍可有效地转化受体细胞。天然质粒用作克隆载体的局限性：（图）51.质粒载体选择记号 在基因克隆中采用的质粒载体
15、，大多数都是使用抗菌素抗性记号，一方面是由于许多质粒本身就带有抗菌素抗性基因的抗药性 R 因子，另一方面因为抗菌素抗性记号具有便于操作、易于选择等优点。下面是克隆中常用的几种抗菌素：a.氨苄青霉素抗性基因(ampr)b.氯霉素抗性基因(cmlr)c.卡那霉素抗生基因(Kanr)d.链霉素抗性基因(strr)e.四环素抗性基因(tetr)2.不同类型的质粒载体（图）五、重要的大肠杆菌质粒载体1pSC101 质粒载体是一种典型的严紧型控制的低拷贝的大肠杆菌质粒载体，是第一个成功地用于在 E.coli 中克隆真核 DNA 的大肠杆菌质粒载体：拷 贝 数： 1-2 个/cell分子大小： 9.09Kb
16、抗性表型： terr2. pBR322 质粒载体（图）6pBR322 质粒载体的构建pBR322 质粒按照标准的质粒载体命名法则命名的.”P”表示它是一种质粒; 而”BR” 分别取自该质粒的两位主要构建者 F.BolivarR.L.Rodriguez 姓氏的头一个字母.”322” 实验编号,和其他质粒载体 pBR325、pBR327 相区别。它是由三个不同来源的部分组成的：第一部分来源于 pSF2124 质粒的氨苄青霉素抗性基因（ampr）第二部分来源于 pSC101 质粒的四环素抗性基因（tetr）第三部分来源于 ColE1 派生的质粒 pMB1 的 DNA 复制起点（ori） pBR322
17、 质粒载体的优点具有较小的分子量，不仅易于自身纯化，而且克隆外源片段可高达 6kb；具有两种抗性基因可供作转化子的选择记号用于筛选；有较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后每个细胞中可积累 10003000 个拷贝。为重组体 DNA 的制备提供了极大的方便。pBR322 质粒载体的缺点：a. pBR322 质粒载体虽然失去了迁移蛋白质基因 mob，但却保留着这种蛋白质的作用位点bom。因此在 F、ColK 和 pBR322 三种质粒共存的情况下，由 ColK 质粒产生的迁移蛋白质就会作用于 pBR322 的 bom 位点，通过 F 质粒提供的转移装置而发生迁移作用。现在已构建了若干种缺失了 bo
18、m 位点的 派生质粒。b. pBR322 质粒上的 EcoRI 位点不会发生插入失活，而 EcoRI 酶又是基因工程中最常用的一种核酸内切限制酶。3. pUC 质粒载体 pUC 是因为它是由美国加利福尼亚大学的科学家 J.Messing 和 J.Vieria 于 1987 年首先构建。由四个部分组成：1.来自 pBR322 质粒的 DNA 复制起点（ori）2.氨苄青霉素抗性基因（ampr） ，但是核酸序列已经发生变化，不含有原先的核酸内切酶的单识别位点3.大肠杆菌 半乳糖苷酶（lacZ ）的启动子及其编码 肽链的 DNA 序列，此结构特称 lacZ基因4.位于 lacZ基因中的靠近 5端的一
19、段多克隆位点（MCS）区段，但它不破坏该基因的功能。 pUC 质粒载体的结构（图）pUC 质粒载体的优点 a.具有更小的分子量和更高拷贝数。例如：pUC8 和 pUC18 分子大小分别为 2750bp 和72686bp，在未经氯霉素扩增的条件下拷贝数可达 500-700 个/cell。b.适于用组织化学方法检测重组体：pUC 质粒载体中的 lacZ基因编码的 -肽链可能与 -互补作用，因此可以用 X-gal-IPTG 组织化学显色反应方法进一步对重组体转化子克隆进行鉴定。c.具有多克隆位点 MCS 区段： pUC 质粒载体中 MCS 区段与 MBmp80 噬菌体上的 MCS 相同，可在这两类载
20、体之间来回穿梭。4.pGEM-3Z 质粒载体pGEM-3Z 是一种和 pUC 系列十分相似的小分子载体，其总长度 2743bp，有一个氨苄青霉素抗性基因（ampr） ，和一个 lacZ基因，并在其中插入多克隆位点 MCS 区段。它与 pUC系列的主要区别：具有两个来自噬菌体的启动子 T7 和 SP6，他们位于一个 lacZ基因多克隆位点 MCS 区的两侧，故在反应体系中加入纯化的 T7 和 SP6 聚合酶，那么外源的基因变化转录出响应的mRNA。图六、质粒载体的稳定性问题克隆有外源基因的质粒载体当其转化到寄主细胞之后会发生一系列的生理变化，影响到自身的稳定性。a.导致寄主细胞发生变化，例如生长
21、速度下降，形态学特征发生变化等。b. 无质粒的大肠杆菌细胞突变体、质粒拷贝数减少的大肠杆菌细胞突变体、克隆基因无法表达的大肠杆菌突变体产生。正是由于此类突变体细胞具较快的生长速度，经过持续增殖之后，其数量便会迅速地超过、甚至取代具正常质粒拷贝数的寄主细胞，成为培养物中的优势群体。质粒不稳定性的类型 结构不稳定性(Structural instability)：由转位作用和重组作用引起的质粒 DNA 的重排与缺失等突变，是造成质粒不稳定性的一个重要原因。分离不稳定性(segregational instability) ：由质粒不平均的缺陷性分配(defective partitioning)所
22、造成的质粒丢失现象，叫做质粒分离的不稳定性。3.2 噬菌体克隆载体8噬菌体英文名为 Bacteriophage，简称 phage，来源于希腊文“phages”，系指吞食之意，乃是一类细菌病毒的总称。来源于希腊文“phagos”，系指吞噬之意，它可以在脱离寄主细胞的状态下保持自己的生命，但一旦脱离了寄主细胞，就既不能生长也不能复制。它在寄主细胞内利用寄主的核糖体、合成蛋白质的因子、各种氨基酸及产能体系，进行生长和增殖。一.噬菌体的一般生物学特性对于寄主细胞的依赖性。保护自己的核酸分子免受环境化学物质的破坏。将核酸分子注入被感染的细菌细胞。被感染的细菌细胞变成制造噬菌体的体系，从而产生大量的子代噬
23、菌体颗粒。使感染的颗粒释放出子代噬菌体。1.噬菌体的结构及核酸类型不同种类的噬菌体颗粒，在结构上有很大的差别。一般来说，可归纳为三种不同的基本类型，无尾部结构的二十面体，具尾部结构的二十面体和线状体。核酸类型：最常见的是双链线性 DNA、双链环形 DNA、单链环形 DNA、单链线形DNA、单链 RNA。不同的噬菌体之间的核酸分子量的差异也是比较大的。2.噬菌体的感染性一个噬菌体颗粒感染一个细菌细胞之后，便可迅速形成数百个子代噬菌体颗粒，而每一个子代颗粒又各能够感染一个新的细菌细胞，在产生数百个子代颗粒，如此只要重复四次感染周期，一个噬菌体颗粒便能够使数十亿个的细菌细胞致死。3.噬菌体的溶菌生命
24、周期噬菌体的生命周期分为溶菌周期和溶源周期只具有溶菌生长周期的噬菌体颗粒叫烈性噬菌体。烈性噬菌体溶菌生长的基本过程：吸附 吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上注入 噬菌体 DNA 穿过细胞壁注入寄主细胞转变 被感染的细胞成为制造噬菌体颗粒的场所合成 大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质组装 包装了 DNA 头部和尾部组装成噬菌体的颗粒释放 合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来（图）4.噬菌体的溶源生命周期9溶源生长周期：是指在感染过程中没有产生出子代噬菌体颗粒，噬菌体的 DNA 是整合到寄主细胞染色体 DNA 上，成为它的一个组成部分。具有这种溶源周期的噬菌体叫温和噬菌体。温和噬菌体：既能进入
25、溶菌生命周期又能进入溶源生命周期。溶源周期的主要特征： 噬菌体和 P1 噬菌体 噬菌体的特征：噬菌体的 DNA 分子注入细菌细胞经过短暂的转录之后，需要合成一种整合酶，于是转录活性便被一种阻遏物所关闭噬菌体的 DNA 分子插入到细菌染色体基因组 DNA 上，变成原噬菌体细菌继续生长、增值，噬菌体的基因作为细菌染色体的一部分进行复制。图：溶源周期二、 噬菌体载体 噬菌体是一种双链 DNA 噬菌体，基因组约为 50kb。迄今已经定位的 噬菌体的基因至少有 61 个，其中有一半左右参与了噬菌体生命周期的活动，成为 噬菌体的必要基因；另一部分，当它们被外源基因取代后，并不影响噬菌体的生命功能，把这部分
26、基因称为 噬菌体的非必要基因。这是 噬菌体赖以发展作为基因克隆载体的一种重要特征。1. 噬菌体的结构*粘性末端 噬菌体的基因组是由双链 DNA 组成，其线性分子的两端各有一条由 12 个核苷酸组成的彼此互补的 5单链突出序列，即通常所说的粘性末端。*cos 位点注入感染寄主细胞内的 DNA 线性分子，会迅速环化形成双链 DNA 分子。这种由粘性结合形成的特定的双链区段称为 cos 位点cos=cohesive-end site，即粘性末端位点*分子长度 噬菌体 DNA 分子长度为 48502bp。*结构为叙述的方便， 噬菌体基因组被人为地划分为三个区域：左侧区自基因 A 到基因 J，包括参与噬
27、菌体头部蛋白和尾部蛋白合成所需的全部基因；中间区介于基因 J 与基因 N 之间，又称为非必要区。该区的编码基因与噬菌斑形成无关，但包括重组相关基因(redA 和 redB)；整合基因(int) ，及删除基因(xis) ；右侧区位于 N 基因的右侧，包括全部的调控基因，如复制基因(O)和溶菌基因(S 及 R)。10图：生物结构2. 噬菌体 DNA 的复制图3 噬菌体载体的构建（1）精简酶切位点图（2）加装选择标记图（3） 噬菌体载体的主要类型图插入型载体：只具有一个可供外源 DNA 插入的克隆位点。这样的派生载体叫插入型载体。外源 DNA 克隆到到插入型的载体，会使噬菌体的某种功能丧失效力。根据
28、插入失活效应的特异性，可分为免疫功能失活和大肠杆菌 -半乳糖苷酶失活。免疫功能失活：图大肠杆菌 -半乳糖苷酶失活 ：图取代型载体：在两个限制位点之间的 DNA 片段可以被插入的外源 DNA 片段所取代，11这样的 派生载体叫取代型载体。在其载体中央部分有一个可以被外源插入 DNA 分子所取代的 DNA 片段，这是由于在构建此载体时，安排在中央可取代片段两侧的多克隆位点是反向重复序列，当外源 DNA 插入时，一对克隆位点之间的 DNA 片段便会被置换掉。 ，从而提高了克隆外源 DNA 片段的能力。（4） -DNA 重组分子的体外包装图4.-DNA 作为载体的优点图三、柯斯质粒载体cosmid 载
29、体：也称粘粒、柯斯载体。这是一类用于克隆大片段 DNA 的载体，它是由 噬菌体的 cos（cohesive）末端及质粒（plasmid）重组而成的载体。因此该载体在体外重组后，可利用噬菌体体外包装的特性进行体外包装，利用噬菌体感染的方式将重组 DNA 导入受体细胞。但它不会产生子代噬菌体，而是以质粒 DNA 的形式存在于细胞内。1.柯斯质粒的克隆能力及其组成柯斯质粒的克隆能力可达 45kb柯斯质粒本身分子量较小，典型的是 5kb-7kb 的环形 DNA 分子，它由如下 4 部分组成：一个质粒的复制起点；一个或数个选择记号；大量的限制酶单一识别位点；一个 cos 位点(此系包装的必要条件)；2.
30、柯斯质粒 pHC79 的构建图phage 中的 cos 序列及其控制包装作用的序列；pBR322 中的完整的复制子：ori、Tetr 基因、Ampr 基因3.柯斯质粒载体的特点（1）具有 噬菌体的特性：a.体外包装后可以高效地转导敏感的 E.coli 细胞；导入细胞12后的 DNA 线性分子可重新环化起来；（2）具有质粒载体的特性；具有质粒复制子，可在寄主细胞内像质粒 DNA 一样进行复制；可在氯霉素作用下扩增，有效提高克隆基因的产量；具有抗菌素抗性基因，便于重组体分子的选择。（3）具有较高容量的克隆能力；（4）具有与同源性序列的质粒进行重组的能力四、 单链 DNA 噬菌体载体M13、f1、f
31、d。都含有长度 6.4kb、彼此具有很高同源性的单链环状的 DNA 分子。 （以 M13噬菌体为例）优越性：（1）单链 DNA 噬菌体的复制，是以双链环形的 DNA 为媒介的，这种复制形式的 DNA 简称 RFDNA；（2）不论是 RFDNA 还是 ssDNA 都能感染大肠杆菌；（3）单链 DNA 噬菌体颗粒的大小，是受其 DNA 的多寡制约的，不存在包装限制问题；（4）容易测定外源 DNA 片断的插入取向；（5）可产生大量纯化的含外源片断的单链 DNA 分子。1. M13 phage 的生物学特性M13 是一种含单键（+ ）DNA（ssDNA）的丝状大肠杆菌噬菌体，其基因组大小为 6.4kb
32、。这类载体主要用来获得大量的单链片段。M13 噬菌体不裂解宿主细胞，但抑制其生长M13 DNA 上至少有 11 个基因图：复制过程2. M13 克隆载体M13 和相关寄主菌株如 JM101。由于它们单独均不能产生有功能活性的 -半乳糖苷酶，只有当 M13 phage 载体和 JM101 一类菌株一道才能产生完全的有功能活性的 -半乳糖苷酶，而且这种酶还可以用 Xgal 显色反应测定出来。当外源基因片段插入到 M13 克隆载体的 lac 区段时，便破坏了该载体形成蓝色噬菌斑的能力而易于重组体的选择。M13 载体系列的优点13（1）克隆在 M13RF DNA 分子上的外源 DNA 片段，到了子代噬
33、菌体便形成单链形式，故可制备单链 DNA（2）M13 载体上有一条饰变的 -半乳糖苷酶基因片段，可以与相应寄主产生互补作用，形成有活性的 -半乳糖苷酶，故可用蓝白筛选机制筛选重组体分子。（3）lacZ 基因上具有一段多克隆序列，因此便于外源 DNA 片段的插入与克隆（4）在 M13mp 克隆载体上的多克隆位点的顺序是已知的，因此经两种不同限制酶消化的DNA 的插入方向，便可判断出来。3.噬菌体展示技术原理：在噬菌体衣壳蛋白基因（Gene 或 Gene ）中插入外源基因，形成融合蛋白表达在噬菌体颗粒蛋白的表面，被展示的多肽或蛋白质可保持相对独立的空间结构和生物学活性。1985 年 Smith 首
34、次通过基因工程的手段,将外源基因插入丝状噬菌体基因组中,从而使表达的外源肽或蛋白与噬菌体外壳蛋白一起展示在噬菌体表面,由此建立了噬菌体展示技术。4.噬菌体表面展示文库将随机的多肽 DNA 克隆在噬菌体展示载体的 Gene编码序列中。将以上重组的噬菌体展示载体感染雄性的大肠杆菌细胞，在寄主细胞中重组的噬菌体展示载体颗粒的表面，展现出各种不同的蛋白质和多肽。此即是通常所说的随机多肽库。 通过亲和层析处理，将所要分离的某种特定的目标噬菌体分离出来。五、噬菌粒载体定义：这是一类由部分质粒载体和部分单链噬菌体载体结合而成具有双功能的新型载体系列，它们都具有两个复制起点，其一来自 ColE1，其二来自单链
35、 DNA 噬菌体 f1。在最简单的情况下，噬菌粒由如下部分构成：质粒部分： a.ColE1 复制起点；b.抗菌素抗性记号；噬菌体部分：c.噬菌体 DNA 复制起点与终点；d.噬菌体形态发生有关的序列；噬菌粒优点： （1）克隆在噬菌粒上的外源 DNA 可以像质粒一样按常规方法增殖，形成双链 DNA，具有常规质粒特性；（2）当带有噬菌粒的大肠杆菌细胞被适当的丝状噬菌体感染之后，在噬菌体 GeneII 蛋白质影响下，噬菌粒的复制方式发生改变。产生单链 DNA 拷贝，并被包装进子代噬菌体颗粒中去。可从这些子代噬菌体颗粒中提取单链 DNA。（3）可直接进行克隆 DNA 片段的序列测定。（4）可产生大片段
36、外源单链 DNA(可得到较长的外源 DNA 之单链序列) 由于载体足够小，故可得到长达 10kb 的外源 DNA 的单链序列。pUC118 和 pUC119 噬菌粒载体 这一对噬菌粒载体是由质粒 pUC18 和 pUC19 和野生型噬菌体 M13 的基因间隔区(IG)重组而成。在 M13 的 IG 间隔区(长 476bp)具有 M13 的复制起点。图14pUC118 和 pUC119 噬菌粒载体的优点1. 具有较小分子量的共价、闭合、环形的基因组 DNA，可克隆 10kb 的外源 DNA 片段，并易于进行分离与操作；2. 编码一个 ampr 基因作为选择记号，因此只有携带 pUC118 或 p
37、UC119 噬菌粒载体的大肠杆菌转化子细胞，才能够在含有氨苄青霉素的培养基中生长，便于转化子的选择；3. 拷贝数含量高，每个寄主可高达 500 个，所以只要用少量的大肠杆菌细胞培养物，便可制备出大量的载体 DNA；4. 存在着一个多克隆位点区，因此许多种不同类型的外源 DNA 片段，不经修饰便可直接插入到载体分子上；5. 由于多克隆位点区阻断了大肠杆菌 lacZ 基因的 5-端编码区，可按照 IPTG 组织化学显色反应试验，筛选重组子；6. lacZ 基因是置于 lac 启动子的控制之下，这样插入的外源基因便会以融合蛋白质的形式表达；7. 含有质粒的复制起点，在没有辅助噬菌体的情况下，克隆的外
38、源基因可以像质粒一样按常规的方式，复制形成大量的双链 DNA 分子8. 带有一个 M13 噬菌体的复制起点，在有辅助噬菌体感染的寄主细胞中，可以合成出单DNA 拷贝，并包装成噬菌体颗分泌到培养基中；9. 在 pUC118 和 pUC119 这两个载体中，多克隆位点区的核苷酸序列取向是彼此相反的，于是它们当中的一个可转录克隆基因的正链 DNA，另一个则可转录出负链 DNA；10. 可以直接对克隆的 DNA 片断进行核苷酸的序列测定，免去了从质粒载体到噬菌体的这一烦琐的亚克隆步骤。1.基因工程载体必须满足哪些基本条件？2.列举质粒载体必须具备的基本特性。 3.什么叫穿梭载体？ 4.如何将野生型的 噬菌体改造成为一个理想的载体?5.什么是蓝白斑筛选法?6.M13 系列载体具有哪些优缺点?7.黏粒载体具有哪些特点与不足?思考：蓝白斑筛选法为什么也会有假阳性?
